Գենետիկական ինժեներիայի մեթոդներ սպիտակուցների արտադրության համար. Նոր գենետիկորեն մշակված սպիտակուցներ, որոնք հիմնված են TNF Efimov Գրիգորի Ալեքսանդրովիչի դեմ ռեկոմբինանտ հակամարմինների վրա: Լյումինեսցենտային սենսորի Vhh41-KTNFin vitro և in vivo կենսաբանական հատկությունների ուսումնասիրություն

Ուղարկել ձեր լավ աշխատանքը գիտելիքների բազայում պարզ է: Օգտագործեք ստորև ներկայացված ձևը

Ուսանողները, ասպիրանտները, երիտասարդ գիտնականները, ովքեր օգտագործում են գիտելիքների բազան իրենց ուսումնառության և աշխատանքի մեջ, շատ շնորհակալ կլինեն ձեզ:

Տեղադրվել է http://www.allbest.ru/

Դասընթացի աշխատանք

մասնագիտություն՝ գյուղատնտեսական կենսատեխնոլոգիա

«Սպիտակուցային ճարտարագիտություն» թեմայով

Շարադրություն
Ներածություն
I. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն

1.1 Սպիտակուցների ճարտարագիտության հայեցակարգը: Զարգացման պատմություն

II. Ինժեներական սպիտակուցների օրինակներ

3.3 Սպիտակուցների ճարտարագիտության որոշ ձեռքբերումներ:

Եզրակացություն
Մատենագիտություն

Թեմա՝ Սպիտակուցների ճարտարագիտություն.

Բանալի բառեր՝ կենսատեխնոլոգիա, գենետիկական ճարտարագիտություն, սպիտակուց, գենետիկ կոդ, գեն, ԴՆԹ, ՌՆԹ, ATP, պեպտիդներ, էպիտոպ:

Դասընթացի աշխատանքի նպատակը. ուսումնասիրել «սպիտակուցային ինժեներություն» հասկացությունը և դրա կիրառման հնարավոր հնարավորությունները:

Սպիտակուցների ճարտարագիտության հնարավոր հնարավորությունները.

1. Փոխակերպվող նյութի` սուբստրատի կապի ուժը ֆերմենտին փոխելով, հնարավոր է բարձրացնել ֆերմենտային ռեակցիայի ընդհանուր կատալիտիկ արդյունավետությունը:

2. Բարձրացնելով սպիտակուցի կայունությունը ջերմաստիճանների և թթվայնության լայն տիրույթում, այն կարող է օգտագործվել այն պայմաններում, երբ սկզբնական սպիտակուցը դենատուրացիա է անում և կորցնում է իր ակտիվությունը:

3. Ստեղծելով սպիտակուցներ, որոնք կարող են գործել անջուր լուծիչներում, հնարավոր է կատալիտիկ ռեակցիաներ իրականացնել ոչ ֆիզիոլոգիական պայմաններում:

4. Փոխելով ֆերմենտի կատալիտիկ կենտրոնը՝ դուք կարող եք մեծացնել նրա սպեցիֆիկությունը և նվազեցնել անցանկալի կողմնակի ռեակցիաների քանակը։

5. Բարձրացնելով սպիտակուցի դիմադրողականությունը այն քայքայող ֆերմենտների նկատմամբ, կարելի է պարզեցնել դրա մաքրման գործընթացը:

6. Փոխելով սպիտակուցը, որպեսզի այն կարողանա գործել առանց իր սովորական ոչ ամինաթթու բաղադրիչի (վիտամին, մետաղի ատոմ և այլն), այն կարող է օգտագործվել որոշ շարունակական տեխնոլոգիական գործընթացներում։

7. Փոխելով ֆերմենտի կարգավորող հատվածների կառուցվածքը, հնարավոր է նվազեցնել ֆերմենտային ռեակցիայի արտադրանքի կողմից դրա արգելակման աստիճանը՝ ըստ բացասական արձագանքի տեսակի և դրանով իսկ բարձրացնել արտադրանքի բերքատվությունը։

8. Հնարավոր է ստեղծել հիբրիդային սպիտակուց, որն ունի երկու կամ ավելի սպիտակուցների ֆունկցիաներ։

9. Հնարավոր է ստեղծել հիբրիդային սպիտակուց, որի հատվածներից մեկը հեշտացնում է հիբրիդային սպիտակուցի արտազատումը մշակված բջջից կամ դրա արդյունահանումը խառնուրդից։

Ներածություն

Հին ժամանակներից ի վեր կենսատեխնոլոգիան օգտագործվել է հիմնականում սննդի և թեթև արդյունաբերության մեջ՝ գինեգործության, հացաբուլկեղենի, կաթնամթերքի խմորման, կտավատի և կաշվի մշակման մեջ՝ հիմնված միկրոօրգանիզմների օգտագործման վրա։ Վերջին տասնամյակների ընթացքում կենսատեխնոլոգիայի հնարավորությունները ահռելիորեն ընդլայնվել են: Դա պայմանավորված է նրանով, որ դրա մեթոդներն ավելի շահավետ են, քան սովորականները, այն պարզ պատճառով, որ կենդանի օրգանիզմներում ֆերմենտներով կատալիզացված կենսաքիմիական ռեակցիաները տեղի են ունենում օպտիմալ պայմաններում (ջերմաստիճան և ճնշում), ավելի արդյունավետ են, էկոլոգիապես մաքուր և քիմիական չեն պահանջում: ռեակտիվներ, որոնք թունավորում են շրջակա միջավայրը.

Կենսատեխնոլոգիայի օբյեկտները կենդանի օրգանիզմների խմբերի բազմաթիվ ներկայացուցիչներ են՝ միկրոօրգանիզմներ (վիրուսներ, բակտերիաներ, նախակենդանիներ, խմորիչներ), բույսեր, կենդանիներ, ինչպես նաև դրանցից մեկուսացված բջիջներ և ենթաբջջային բաղադրիչներ (օրգանելներ) և նույնիսկ ֆերմենտներ: Կենսատեխնոլոգիան հիմնված է կենդանի համակարգերում տեղի ունեցող ֆիզիոլոգիական և կենսաքիմիական գործընթացների վրա, որոնք հանգեցնում են էներգիայի ազատմանը, նյութափոխանակության արտադրանքի սինթեզին և քայքայմանը, ինչպես նաև բջջի քիմիական և կառուցվածքային բաղադրիչների ձևավորմանը:

Կենսատեխնոլոգիայի հիմնական ուղղությունը միկրոօրգանիզմների և էուկարիոտիկ բջիջների օգտագործմամբ կենսաբանորեն ակտիվ միացությունների (ֆերմենտներ, վիտամիններ, հորմոններ), դեղամիջոցների (հակաբիոտիկներ, պատվաստանյութեր, շիճուկներ, բարձր սպեցիֆիկ հակամարմիններ և այլն) արտադրությունն է, ինչպես նաև արժեքավոր միացություններ ( կերային հավելումներ, օրինակ՝ էական ամինաթթուներ, կերային սպիտակուցներ և այլն)։

Գենային ինժեներիայի մեթոդները հնարավորություն են տվել արդյունաբերական քանակությամբ սինթեզել այնպիսի հորմոններ, ինչպիսիք են ինսուլինը և սոմատոտրոպինը (աճի հորմոն), որոնք անհրաժեշտ են մարդու գենետիկ հիվանդությունների բուժման համար:

Կենսատեխնոլոգիան լուծում է ոչ միայն գիտության և արտադրության կոնկրետ խնդիրներ։ Այն ունի ավելի գլոբալ մեթոդաբանական խնդիր. այն ընդլայնում և արագացնում է կենդանի բնության վրա մարդու ազդեցության մասշտաբը և նպաստում է կենդանի համակարգերի հարմարեցմանը մարդու գոյության պայմաններին, այսինքն՝ նոսֆերային: Այսպիսով, կենսատեխնոլոգիան հանդես է գալիս որպես մարդածին հարմարվողական էվոլյուցիայի հզոր գործոն:

Կենսատեխնոլոգիան, գենետիկական և բջջային ճարտարագիտությունը խոստումնալից հեռանկարներ ունեն։ Քանի որ ավելի ու ավելի շատ նոր վեկտորներ են հայտնվում, մարդիկ դրանք կօգտագործեն անհրաժեշտ գեները բույսերի, կենդանիների և մարդկանց բջիջներ ներմուծելու համար: Սա թույլ կտա աստիճանաբար ազատվել մարդու ժառանգական բազմաթիվ հիվանդություններից, ստիպել բջիջներին սինթեզել անհրաժեշտ դեղամիջոցներն ու կենսաբանորեն ակտիվ միացությունները, այնուհետև ուղղակիորեն սննդի մեջ օգտագործվող սպիտակուցներն ու էական ամինաթթուները: Բնության կողմից արդեն յուրացված մեթոդների կիրառմամբ՝ կենսատեխնոլոգները հույս ունեն ֆոտոսինթեզի միջոցով ջրածին ստանալ՝ ապագայի էկոլոգիապես մաքուր վառելիքը՝ էլեկտրականությունը, և նորմալ պայմաններում մթնոլորտային ազոտը վերածել ամոնիակի:

Բնական սպիտակուցների ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները հաճախ չեն բավարարում այն պայմաններին, որոնց դեպքում այդ սպիտակուցները կօգտագործվեն մարդկանց կողմից: Պահանջվում է նրա առաջնային կառուցվածքի փոփոխություն, որը կապահովի նախկինից տարբեր տարածական կառուցվածք ունեցող սպիտակուցի ձևավորում և նոր ֆիզիկաքիմիական հատկություններ՝ թույլ տալով նրան այլ պայմաններում կատարել բնական սպիտակուցին բնորոշ գործառույթները: Սպիտակուցների ինժեներությունը զբաղվում է սպիտակուցների կառուցմամբ:

Սպիտակուցների ճարտարագիտության կիրառման մեկ այլ ուղղություն է սպիտակուցների ստեղծումը, որոնք կարող են չեզոքացնել նյութերը և միկրոօրգանիզմները, որոնք կարող են օգտագործվել քիմիական և կենսաբանական հարձակումների համար: Օրինակ, հիդրոլազային ֆերմենտները ունակ են չեզոքացնել ինչպես նյարդային գազերը, այնպես էլ գյուղատնտեսության մեջ օգտագործվող թունաքիմիկատները: Ավելին, ֆերմենտների արտադրությունը, պահպանումն ու օգտագործումը վտանգավոր չէ շրջակա միջավայրի և մարդու առողջության համար։

Փոփոխված սպիտակուց ստանալու համար օգտագործվում են կոմբինատոր քիմիայի մեթոդներ և իրականացվում է ուղղորդված մուտագենեզ՝ ներմուծելով հատուկ փոփոխություններ ԴՆԹ-ի կոդավորման հաջորդականություններում՝ հանգեցնելով ամինաթթուների հաջորդականությունների որոշակի փոփոխությունների: Ցանկալի հատկություններով սպիտակուցը արդյունավետ ձևավորելու համար անհրաժեշտ է իմանալ սպիտակուցի տարածական կառուցվածքի ձևավորման օրինաչափությունները, որոնցից կախված են նրա ֆիզիկաքիմիական հատկությունները և գործառույթները, այսինքն՝ անհրաժեշտ է իմանալ, թե ինչպես է սպիտակուցի առաջնային կառուցվածքը։ , նրա ամինաթթուներից յուրաքանչյուրի մնացորդը ազդում է սպիտակուցի հատկությունների և գործառույթների վրա։ Ցավոք սրտի, սպիտակուցների մեծ մասի համար երրորդային կառուցվածքն անհայտ է, միշտ չէ, որ հայտնի է, թե որ ամինաթթուն կամ ամինաթթուների հաջորդականությունը պետք է փոխվի, որպեսզի ստացվի ցանկալի հատկություններով սպիտակուց: Արդեն այժմ համակարգչային վերլուծության միջոցով գիտնականները կարող են կանխատեսել բազմաթիվ սպիտակուցների հատկությունները՝ հիմնվելով դրանց ամինաթթուների մնացորդների հաջորդականության վրա: Նման վերլուծությունը մեծապես կհեշտացնի ցանկալի սպիտակուցների ստեղծման ընթացակարգը: Մինչդեռ ցանկալի հատկություններով մոդիֆիկացված սպիտակուց ստանալու համար հիմնականում այլ կերպ են գնում՝ մի քանի մուտանտ գեն են ստանում և դրանցից մեկի սպիտակուցային արտադրանքը գտնում, որն ունի ցանկալի հատկություններ։

Տարբեր փորձարարական մոտեցումներ օգտագործվում են տեղամասային մուտագենեզի համար: Ձևափոխված գենը ստանալով՝ այն ինտեգրվում է գենետիկական կառուցվածքի մեջ և ներմուծվում պրոկարիոտ կամ էուկարիոտ բջիջներ, որոնք սինթեզում են այս գենետիկական կառուցվածքով կոդավորված սպիտակուցը։

I. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն

1.1 Սպիտակուցների ճարտարագիտության հայեցակարգը: Զարգացման պատմություն

Սպիտակուցների ճարտարագիտությունը կենսատեխնոլոգիայի մի ճյուղ է, որը զբաղվում է օգտակար կամ արժեքավոր սպիտակուցների մշակմամբ։ Սա համեմատաբար նոր դիսցիպլին է, որը կենտրոնանում է սպիտակուցների ծալման և սպիտակուցի ձևափոխման և ստեղծման սկզբունքների ուսումնասիրության վրա:

Սպիտակուցների ճարտարագիտության երկու հիմնական ռազմավարություն կա՝ ուղղորդված սպիտակուցի փոփոխություն և ուղղորդված էվոլյուցիա: Այս մեթոդները միմյանց բացառող չեն. հետազոտողները հաճախ օգտագործում են երկուսն էլ: Ապագայում սպիտակուցի կառուցվածքի և ֆունկցիայի ավելի մանրամասն իմացությունը, ինչպես նաև բարձր տեխնոլոգիաների առաջընթացը կարող է զգալիորեն ընդլայնել սպիտակուցային ինժեներիայի հնարավորությունները: Արդյունքում, նույնիսկ անբնական ամինաթթուները կարող են ներառվել նոր մեթոդի շնորհիվ, որը թույլ է տալիս նոր ամինաթթուներ ներառել գենետիկ կոդի մեջ:

Սպիտակուցների ճարտարագիտությունը ծագել է սպիտակուցների ֆիզիկայի և քիմիայի և գենետիկական ինժեներիայի խաչմերուկում: Այն լուծում է մոդիֆիկացված կամ հիբրիդային սպիտակուցային մոլեկուլների ստեղծման խնդիրը՝ նշված բնութագրերով: Նման առաջադրանքի իրականացման բնական միջոց է կանխատեսել փոփոխված սպիտակուցը կոդավորող գենի կառուցվածքը, իրականացնել դրա սինթեզը, կլոնավորումը և արտահայտումը ստացող բջիջներում:

Առաջին վերահսկվող սպիտակուցի փոփոխությունն իրականացվել է 60-ականների կեսերին Կոշլանդի և Բենդերի կողմից։ Հիդրօքսիլ խումբը պրոթեզերոնի ակտիվ կենտրոնում՝ սուբտիլիսինում սուլֆիհիդրիլ խմբով փոխարինելու համար նրանք օգտագործել են քիմիական փոփոխության մեթոդ։ Սակայն, ինչպես պարզվեց, նման թիոլսուբտիլիսինը չի պահպանում պրոթեզերոնի ակտիվությունը։

Քիմիապես սպիտակուցը մոլեկուլի մեկ տեսակ է, որը պոլիամինաթթուների շղթա կամ պոլիմեր է։ Այն կազմված է 20 տեսակի ամինաթթուների հաջորդականություններից։ Մարդիկ, իմանալով սպիտակուցների կառուցվածքը, հարց տվեցին. հնարավո՞ր է ամինաթթուների բոլորովին նոր հաջորդականություններ նախագծել, որպեսզի նրանք կատարեն այն գործառույթները, որոնք անհրաժեշտ են մարդկանց, քան սովորական սպիտակուցները: Protein Engineering անվանումը տեղին էր այս գաղափարին:

Նման ճարտարագիտության մասին մարդիկ սկսել են մտածել դեռ 20-րդ դարի 50-ական թվականներին։ Դա տեղի է ունեցել առաջին սպիտակուցային ամինաթթուների հաջորդականությունների վերծանումից անմիջապես հետո: Աշխարհի բազմաթիվ լաբորատորիաներում փորձեր են արվել կրկնօրինակել բնությունը և քիմիական կերպով սինթեզել տրված բացարձակապես կամայական պոլիամինաթթուների հաջորդականությունները:

Դա ամենաշատը հաջողվեց քիմիկոս Բ.Մերիֆիլդին։ Այս ամերիկացուն հաջողվել է մշակել պոլիամինաթթուների շղթաների սինթեզի չափազանց արդյունավետ մեթոդ։ Դրա համար Մերրիֆիլդը 1984 թվականին արժանացել է քիմիայի Նոբելյան մրցանակի։

Նկար 1. Սխեման, թե ինչպես է աշխատում սպիտակուցային ճարտարագիտությունը:

Ամերիկացին սկսեց սինթեզել կարճ պեպտիդներ, այդ թվում՝ հորմոններ։ Միևնույն ժամանակ նա կառուցեց ավտոմատ՝ «քիմիական ռոբոտ», որի խնդիրն էր արհեստական սպիտակուցներ արտադրել։ Ռոբոտը գիտական շրջանակներում սենսացիա է առաջացրել. Սակայն շուտով պարզ դարձավ, որ նրա արտադրանքը չի կարող մրցել բնության արտադրածի հետ։

Ռոբոտը չի կարողացել ճշգրիտ վերարտադրել ամինաթթուների հաջորդականությունը, այսինքն՝ սխալներ է թույլ տվել։ Նա մի շղթա սինթեզեց մի հաջորդականությամբ, իսկ մյուսը՝ մի փոքր փոփոխված։ Բջջում մեկ սպիտակուցի բոլոր մոլեկուլները իդեալականորեն նման են միմյանց, այսինքն՝ դրանց հաջորդականությունը բացարձակապես նույնական է։

Մեկ այլ խնդիր կար. Նույնիսկ այն մոլեկուլները, որոնք ռոբոտը ճիշտ է սինթեզել, չեն ստացել այն տարածական ձևը, որն անհրաժեշտ է ֆերմենտի գործելու համար։ Այսպիսով, բնությունը օրգանական քիմիայի սովորական մեթոդներով փոխարինելու փորձը հանգեցրեց շատ համեստ հաջողության։

Գիտնականները կարող էին սովորել միայն բնությունից՝ փնտրելով սպիտակուցների անհրաժեշտ փոփոխությունները: Բանն այստեղ այն է, որ բնության մեջ մշտապես տեղի են ունենում մուտացիաներ, որոնք հանգեցնում են սպիտակուցների ամինաթթուների հաջորդականության փոփոխության: Եթե դուք ընտրում եք անհրաժեշտ հատկություններով մուտանտներ, որոնք ավելի արդյունավետ կերպով մշակում են որոշակի սուբստրատ, ապա կարող եք այդպիսի մուտանտից առանձնացնել փոփոխված ֆերմենտը, որի շնորհիվ բջիջը ձեռք է բերում նոր հատկություններ: Բայց այս գործընթացը շատ երկար ժամանակ է պահանջում։

Ամեն ինչ փոխվեց, երբ հայտնվեց գենետիկական ճարտարագիտությունը։ Նրա շնորհիվ նրանք սկսեցին արհեստական գեներ ստեղծել ցանկացած նուկլեոտիդային հաջորդականությամբ։ Այս գեները տեղադրվեցին պատրաստված վեկտորի մոլեկուլների մեջ, իսկ ԴՆԹ-ն ներմուծվեց բակտերիաների կամ խմորիչների մեջ: Այնտեղ արհեստական գենից վերցվել է ՌՆԹ-ի պատճենը։ Արդյունքում ստացվել է անհրաժեշտ սպիտակուցը։ Բացառվեցին դրա սինթեզի սխալները։ Հիմնական բանը ԴՆԹ-ի ճիշտ հաջորդականությունն ընտրելն էր, իսկ հետո բջջի ֆերմենտային համակարգն ինքն անթերի կատարեց իր գործը: Այսպիսով, մենք կարող ենք եզրակացնել, որ գենետիկական ճարտարագիտությունը ճանապարհ է բացել դեպի սպիտակուցային ճարտարագիտություն իր ամենաարմատական ձևով:

1.2 Սպիտակուցների ինժեներական ռազմավարություններ

Սպիտակուցի նպատակային փոփոխություն. Սպիտակուցների նպատակային մոդիֆիկացիայի ժամանակ գիտնականը օգտագործում է սպիտակուցի կառուցվածքի և ֆունկցիայի մանրամասն գիտելիքներ՝ ցանկալի փոփոխություններ կատարելու համար: Ընդհանուր առմամբ, այս մեթոդն ունի էժան և տեխնիկապես ոչ բարդ լինելու առավելություն, քանի որ տեղայնացված մուտագենեզի տեխնիկան լավ զարգացած է: Այնուամենայնիվ, դրա հիմնական թերությունն այն է, որ սպիտակուցի մանրամասն կառուցվածքի մասին տեղեկատվությունը հաճախ բացակայում է, և նույնիսկ երբ կառուցվածքը հայտնի է, շատ դժվար է կանխատեսել տարբեր մուտացիաների ազդեցությունը:

Սպիտակուցների փոփոխման ծրագրային ալգորիթմները ձգտում են բացահայտել ամինաթթուների նոր հաջորդականությունները, որոնք քիչ էներգիա են պահանջում նախապես սահմանված թիրախային կառուցվածք ձևավորելու համար: Թեև հաջորդականությունը, որը պետք է գտնվի, մեծ է, սպիտակուցի փոփոխման ամենադժվար պահանջը օպտիմալ հաջորդականությունը բացահայտելու և սահմանելու արագ, բայց ճշգրիտ միջոցն է՝ ի տարբերություն նմանատիպ ենթաօպտիմալ հաջորդականությունների:

Ուղղորդված էվոլյուցիա. Ուղղորդված էվոլյուցիայում պատահական մուտագենեզը կիրառվում է սպիտակուցի վրա, և ընտրություն է կատարվում՝ որոշակի որակ ունեցող տարբերակներ ընտրելու համար: Հաջորդը, կիրառվում են մուտացիայի և ընտրության ավելի շատ փուլեր: Այս մեթոդը ընդօրինակում է բնական էվոլյուցիան և, ընդհանուր առմամբ, բարձր արդյունքներ է տալիս ուղղորդված փոփոխության համար:

Լրացուցիչ տեխնիկան, որը հայտնի է որպես ԴՆԹ-ի խառնում, խառնում և բացահայտում է հաջող տարբերակների մասերը՝ ավելի լավ արդյունքներ ապահովելու համար: Այս գործընթացը կրկնօրինակում է սեռական վերարտադրության ընթացքում բնականաբար տեղի ունեցող ռեկոմբինացիաները: Ուղղորդված էվոլյուցիայի առավելությունն այն է, որ այն չի պահանջում սպիտակուցի կառուցվածքի նախնական գիտելիքներ, ոչ էլ անհրաժեշտ է կանխատեսել, թե տվյալ մուտացիան ինչ ազդեցություն կունենա: Իրոք, ուղղորդված էվոլյուցիոն փորձերի արդյունքները զարմանալի են, քանի որ ցանկալի փոփոխությունները հաճախ պայմանավորված են մուտացիաներով, որոնք չպետք է ունենան նման ազդեցություն: Թերությունն այն է, որ այս մեթոդը պահանջում է բարձր թողունակություն, ինչը հնարավոր չէ բոլոր սպիտակուցների համար: Մեծ քանակությամբ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն պետք է մուտացիայի ենթարկվի, և արտադրանքը պետք է ստուգվի ցանկալի որակի համար: Ընտրանքների հսկայական քանակությունը հաճախ պահանջում է ռոբոտաշինության ձեռքբերում՝ գործընթացը ավտոմատացնելու համար: Բացի այդ, միշտ չէ, որ հեշտ է զննել բոլոր հետաքրքրությունները:

II. Ինժեներական սպիտակուցների օրինակներ

Սպիտակուցների ճարտարագիտությունը կարող է հիմնված լինել պատրաստի սպիտակուցի քիմիական փոփոխության կամ գենետիկական ինժեներիայի մեթոդների վրա, որոնք հնարավորություն են տալիս ստանալ բնական սպիտակուցների փոփոխված տարբերակներ:

Հատուկ կենսաբանական կատալիզատորի նախագծումն իրականացվում է հաշվի առնելով ինչպես սպիտակուցի առանձնահատկությունը, այնպես էլ օրգանոմետաղական համալիրի կատալիտիկ ակտիվությունը։ Ահա նման ձևափոխման օրինակներ, որոնք իրականացվել են «կիսասինթետիկ կենսաօրգանական համալիրներ» ստանալու համար։ Սերմնահեղուկի միոգլոբինը ունակ է կապելու թթվածինը, բայց չունի կենսակատալիտիկ ակտիվություն: Այս բիոմոլեկուլի համակցման արդյունքում ռութենիում պարունակող երեք էլեկտրոնների փոխանցման կոմպլեքսներ, որոնք կապում են սպիտակուցի մոլեկուլների մակերեսի հիստիդինի մնացորդներին, ձևավորվում է մի բարդույթ, որն ունակ է նվազեցնել թթվածինը, միաժամանակ օքսիդացնելով մի շարք օրգանական սուբստրատներ. որպես ասկորբատ, գրեթե նույն արագությամբ, ինչ բնական ասկորբատ օքսիդազի համար: Սկզբունքորեն, սպիտակուցները կարող են փոփոխվել այլ ձևերով: Դիտարկենք, օրինակ, պապաինը։ Այն լավ ուսումնասիրված պրոտեոլիտիկ ֆերմենտներից է, որի համար որոշվել է եռաչափ կառուցվածք։ Սպիտակուցի մոլեկուլի մակերեսի վրա ցիստեին-25 մնացորդի մոտ կա երկարացված ակոս, որում տեղի է ունենում պրոտեոլիզի ռեակցիա: Այս տեղամասը կարող է ալկիլացվել ֆլավինի ածանցյալի միջոցով՝ առանց փոխելու ենթաշերտի կապող պոտենցիալ տեղամասի հասանելիությունը: Նման ձևափոխված ֆլավոպապաինները օգտագործվել են M-ալկիլ-1,4-դիհիդրոնիկոտինամիդների օքսիդացման համար, և այդ փոփոխված սպիտակուցներից որոշների կատալիտիկ ակտիվությունը զգալիորեն ավելի բարձր է եղել, քան բնական ֆլավոպրոտեին-NADH դեհիդրոգենազները: Այսպիսով, հնարավոր եղավ ստեղծել շատ արդյունավետ կիսասինթետիկ ֆերմենտ։ Ֆլավինների օգտագործումը բարձր ակտիվ, դիրքավորված էլեկտրոնները հանող փոխարինիչներով կարող է հնարավորություն տալ մշակել արդյունավետ կատալիզատորներ նիկոտինամիդը նվազեցնելու համար:

ԴՆԹ-ի քիմիական սինթեզում վերջերս ձեռք բերված հիմնական առաջընթացը սկզբունքորեն նոր հնարավորություններ է բացել սպիտակուցային ինժեներիայի համար՝ բնության մեջ չգտնվող եզակի սպիտակուցների ձևավորում: Սա պահանջում է տեխնոլոգիայի հետագա զարգացում, որպեսզի գեների փոփոխումը գենետիկական ինժեներիայի մեթոդներով հանգեցնի սպիտակուցների կանխատեսելի փոփոխությունների, դրանց հստակ սահմանված ֆունկցիոնալ բնութագրերի բարելավմանը. ակտիվություն ոչ ջրային լուծիչներում, սուբստրատի և ռեակցիայի առանձնահատկությունը, կոֆակտորների պահանջները, pH օպտիմալը, պրոթեզերոնի դիմադրությունը, ալոստերիկ կարգավորումը, մոլեկուլային քաշը և ենթամիավորի կառուցվածքը: Սովորաբար, նման բարելավումը ձեռք է բերվել մուտագենեզի և սելեկցիայի միջոցով, իսկ վերջերս՝ քիմիական ձևափոխման և անշարժացման միջոցով: Սպիտակուցի որոշակի տեսակի մոլեկուլի հաջող նախագծման համար անհրաժեշտ է բացահայտել մի շարք հիմնարար օրինաչափություններ, որոնք կապում են սպիտակուցների կառուցվածքային առանձնահատկությունները և դրանց ցանկալի հատկությունները: Այսպիսով, իմանալով ուսումնասիրվող սպիտակուցի մոլեկուլի բյուրեղային կառուցվածքը, հնարավոր է բացահայտել դրա այն մասերը, որոնք պետք է հատուկ ձևափոխվեն՝ բարձրացնելու նրա կատալիտիկ ակտիվությունը: Նման փոփոխությունը կարող է բաղկացած լինել սպիտակուցի ամինաթթուների հաջորդականության փոփոխումից:

Մեկ այլ օրինակ է տեղամասային մուտագենեզի իրականացումը: Դա տեղի է ունենում հետևյալ կերպ. Հետազոտողին հետաքրքրող սպիտակուցի գենը կլոնավորվում և տեղադրվում է համապատասխան գենետիկ կրիչի մեջ: Այնուհետև սինթեզվում է ցանկալի մուտացիայով օլիգոնուկլեոտիդային այբբենարան, որի հաջորդականությունը, որը բաղկացած է տասը-տասնհինգ նուկլեոտիդից, բավականաչափ հոմոլոգ է բնական գենի որոշակի հատվածի հետ և, հետևաբար, ունակ է դրա հետ հիբրիդային կառուցվածք կազմել: Այս սինթետիկ այբբենարանը օգտագործվում է պոլիմերազների կողմից՝ վեկտորի լրացուցիչ կրկնօրինակի սինթեզը սկսելու համար, որն այնուհետև առանձնացվում է բնօրինակից և օգտագործվում մուտանտ սպիտակուցի վերահսկվող սինթեզի համար: Այլընտրանքային մոտեցումը հիմնված է շղթայի ճեղքման, փոփոխվող տեղամասի հեռացման և ցանկալի նուկլեոտիդային հաջորդականությամբ սինթետիկ անալոգով փոխարինման վրա:

Թիրոսիլ-tRNA սինթետազը կատալիզացնում է թիրոզինի tRNA-ի ամինոացիլացման ռեակցիան, որը ներառում է թիրոզինի ակտիվացում ATP-ով` թիրոսիլ ադենիլատ ձևավորելու համար: Այս ֆերմենտի գենը, որը մեկուսացված է Bacillus stearothermophilus-ից, մտցվել է բակտերիոֆագ M13: Ֆերմենտի կատալիտիկ հատկությունները, հատկապես սուբստրատը կապելու նրա ունակությունը, այնուհետև փոխվել են տեղանքի հատուկ ձևափոխմամբ: Այսպիսով, թրեոնին-51-ը փոխարինվեց ալանինով։ Սա հանգեցրեց ենթաշերտի կապակցման կրկնակի աճի, ըստ երևույթին, այս մնացորդի և թիրոսիլ ադենիլատի միջև ջրածնային կապ ստեղծելու անկարողության պատճառով: Ալանինը պրոլինով փոխարինելիս ֆերմենտի մոլեկուլի կոնֆիգուրացիան խաթարվում է, բայց սուբստրատը կապելու ունակությունը հարյուրապատիկ ավելանում է, քանի որ հեշտանում է նրա փոխազդեցությունը հիստիդին-48-ի հետ: Նմանատիպ տեղային փոփոխություններ են ձեռք բերվել β-լակտամազայում, և դրանք սովորաբար ուղեկցվում են ֆերմենտի ինակտիվացմամբ: Սերին-70-ը ցիստեինով փոխարինելը հանգեցնում է p-thiol lactamase-ի ձևավորմանը, որի կապակցման հաստատունը չի տարբերվում բնական ֆերմենտից, սակայն պենիցիլինի նկատմամբ ակտիվությունը կազմում է ընդամենը 1-2%: Այնուամենայնիվ, այս մուտանտ ֆերմենտի ակտիվությունը որոշ ակտիվացված ցեֆալոսպորինների նկատմամբ ոչ պակաս է սկզբնական ակտիվությունից կամ նույնիսկ գերազանցում է այն. այս սպիտակուցները նույնպես ավելի դիմացկուն են պրոթեզերոնի նկատմամբ:

Կայքին հատուկ մուտացիաներն այժմ օգտագործվում են կառուցվածքային ուսումնասիրությունների համապատասխանությունը ստուգելու համար: Որոշ դեպքերում նրանք կարողացան ցույց տալ, որ սպիտակուցի կառուցվածքային կայունությունը և նրա կատալիտիկ ակտիվությունը կարող են անջատվել: Բավական քանակությամբ տեղեկատվություն է կուտակվել սպիտակուցի կառուցվածքի կայունության և նրա ֆունկցիայի միջև փոխհարաբերությունների վերաբերյալ, մենք կարող ենք կարգավորել կենսաբանական կատալիզատորների ակտիվությունը և ստեղծել դրանց լիովին սինթետիկ անալոգներ: Վերջերս հայտնվեց աշխատանք, որը հաղորդում էր առաջին սինթետիկ ֆերմենտի գենի կլոնավորման մասին, որը կոդավորում է ռիբոնուկլեազի մոլեկուլի ակտիվ հատվածը:

III. Սպիտակուցների ճարտարագիտության կիրառություններ

Սպիտակուցների ինժեներական տեխնոլոգիան օգտագործվում է (հաճախ՝ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ մեթոդի հետ համատեղ)՝ բարելավելու գոյություն ունեցող սպիտակուցների հատկությունները (ֆերմենտներ, հակամարմիններ, բջջային ընկալիչներ) և ստեղծել նոր սպիտակուցներ, որոնք գոյություն չունեն բնության մեջ։ Նման սպիտակուցներն օգտագործվում են դեղամիջոցներ ստեղծելու, սննդի վերամշակման և արդյունաբերական արտադրության մեջ։

Ներկայումս սպիտակուցային ճարտարագիտության ամենահայտնի կիրառումը ֆերմենտների կատալիտիկ հատկությունների փոփոխումն է՝ «էկոլոգիապես մաքուր» արդյունաբերական գործընթացներ զարգացնելու համար: Բնապահպանական տեսանկյունից ֆերմենտներն ամենաընդունելին են արդյունաբերության մեջ օգտագործվող բոլոր կատալիզատորներից։ Սա ապահովված է կենսակատալիզատորների՝ ջրում լուծվելու և չեզոք pH-ով և համեմատաբար ցածր ջերմաստիճանի միջավայրում լիարժեք գործելու ունակությամբ: Բացի այդ, իրենց բարձր յուրահատկության պատճառով կենսակատալիզատորների օգտագործումը հանգեցնում է արտադրության շատ քիչ անցանկալի կողմնակի արտադրանքների: Էկոլոգիապես մաքուր և էներգախնայող արդյունաբերական գործընթացները, որոնք օգտագործում են կենսակատալիզատորները, վաղուց ակտիվորեն ներդրվել են քիմիական, տեքստիլ, դեղագործական, ցելյուլոզայի և թղթի, սննդի, էներգետիկայի և ժամանակակից արդյունաբերության այլ ոլորտներում:

Այնուամենայնիվ, կենսակատալիզատորների որոշ բնութագրեր որոշ դեպքերում անընդունելի են դարձնում դրանց օգտագործումը: Օրինակ, ֆերմենտների մեծ մասը քայքայվում է, երբ ջերմաստիճանը բարձրանում է: Գիտնականները փորձում են հաղթահարել նման խոչընդոտները և բարձրացնել ֆերմենտների կայունությունը կոշտ արտադրության պայմաններում՝ օգտագործելով սպիտակուցների ինժեներական տեխնիկան։

Արդյունաբերական կիրառություններից բացի, սպիտակուցային ճարտարագիտությունը արժանի տեղ է գտել բժշկական զարգացումներում: Հետազոտողները սինթեզում են սպիտակուցներ, որոնք կարող են կապվել և չեզոքացնել ուռուցքներ առաջացնող վիրուսներին և մուտանտ գեներին; ստեղծելով բարձր արդյունավետ պատվաստանյութեր և ուսումնասիրելով բջիջների մակերեսի ընկալիչների սպիտակուցները, որոնք հաճախ թիրախներ են դեղագործության համար: Սննդի գիտնականները օգտագործում են սպիտակուցային ճարտարագիտություն՝ բարելավելու բույսերի վրա հիմնված սպիտակուցների և գելացնող նյութերի կամ խտացնող նյութերի պահպանման հատկությունները:

3.1 Պեպտիդային և էպիտոպային գրադարաններ

Կենդանի օրգանիզմում կենսաբանական գործընթացների մեծ մասը վերահսկվում է սպիտակուց-սպիտակուց կամ սպիտակուց-նուկլեինաթթու հատուկ փոխազդեցությունների միջոցով: Նման գործընթացները ներառում են, օրինակ, գեների տրանսկրիպցիայի կարգավորումը տարբեր սպիտակուցային գործոնների ազդեցության տակ, սպիտակուցային լիգանների փոխազդեցությունը բջիջների մակերեսի ընկալիչների հետ, ինչպես նաև համապատասխան հակամարմիններով անտիգենների հատուկ կապակցումը: Մեծ հիմնարար և կիրառական նշանակություն ունի սպիտակուցային լիգանների փոխազդեցության մոլեկուլային մեխանիզմների ընկալումը ընկալիչների հետ: Մասնավորապես, նոր սպիտակուցային դեղամիջոցների մշակումը սովորաբար սկսվում է նախնական ամինաթթուների հաջորդականության նույնականացումից, որն ունի անհրաժեշտ կենսաբանական ակտիվություն (այսպես կոչված «առաջատար» հաջորդականությունը): Սակայն հիմնական ամինաթթուների հաջորդականությամբ պեպտիդները կարող են ունենալ նաև անցանկալի կենսաբանական հատկություններ՝ ցածր ակտիվություն, թունավորություն, ցածր կայունություն մարմնում և այլն։

Մինչ պեպտիդային գրադարանների հայտնվելը, դրանց կենսաբանական հատկությունների բարելավումն իրականացվում էր մեծ թվով անալոգների հաջորդական սինթեզով և դրանց կենսագործունեության փորձարկումով, ինչը պահանջում էր շատ ժամանակ և գումար: Վերջին տարիներին հնարավոր է դարձել կարճ ժամանակում ստեղծել հազարավոր տարբեր պեպտիդներ՝ օգտագործելով ավտոմատ սինթեզատորներ։ Նպատակային մուտագենեզի մշակված մեթոդները նաև հնարավորություն են տվել կտրուկ ընդլայնել միաժամանակ և կենսաբանական ակտիվության համար հաջորդաբար փորձարկվող սպիտակուցների քանակը։ Այնուամենայնիվ, պեպտիդային գրադարանների ստեղծման միայն վերջերս մշակված մոտեցումները ստեղծել են միլիոնավոր ամինաթթուների հաջորդականություններ, որոնք պահանջվում են արդյունավետորեն ստուգելու համար պեպտիդները, որոնք լավագույնս համապատասխանում են չափանիշներին: Նման գրադարաններն օգտագործվում են հակամարմինների փոխազդեցությունը անտիգենների հետ ուսումնասիրելու, նոր ֆերմենտային արգելակիչներ և հակամանրէային նյութեր ստանալու, ցանկալի կենսաբանական ակտիվությամբ մոլեկուլներ նախագծելու կամ սպիտակուցներին, օրինակ՝ հակամարմիններին, նոր հատկություններ հաղորդելու համար:

Ելնելով պատրաստման եղանակներից՝ պեպտիդային գրադարանները բաժանվում են երեք խմբի. Առաջին խումբը ներառում է պեպտիդների քիմիական սինթեզի միջոցով ստացված գրադարաններ, որոնցում առանձին պեպտիդներ անշարժացված են միկրոկրիչների վրա։ Այս մոտեցմամբ, միկրոկրիչների վրա անշարժացված պեպտիդներին առանձին ռեակցիոն խառնուրդներում հաջորդական ամինաթթուների ավելացումից հետո, բոլոր ռեակցիայի խառնուրդների պարունակությունը միացվում է և բաժանվում նոր մասերի, որոնք օգտագործվում են նոր ամինաթթուների մնացորդների ավելացման հաջորդ փուլում: Նման մի շարք քայլերից հետո սինթեզվում են պեպտիդներ, որոնք պարունակում են սինթեզում օգտագործվող ամինաթթուների հաջորդականությունը բոլոր տեսակի պատահական համակցություններում:

Միկրոկրիչների վրա անշարժացված պեպտիդների գրադարաններն ունեն զգալի թերություն. դրանք զննման ժամանակ պահանջում են մաքրված ընկալիչների օգտագործումը լուծելի վիճակում: Միևնույն ժամանակ, շատ դեպքերում մեմբրանի հետ կապված ընկալիչները առավել հաճախ օգտագործվում են հիմնական և դեղաբանական հետազոտությունների համար իրականացվող կենսաբանական թեստերում: Երկրորդ մեթոդի համաձայն, պեպտիդային գրադարանները ստացվում են պինդ փուլային պեպտիդների սինթեզի միջոցով, որում աճող պեպտիդային շղթաներին հաջորդ ամինաթթվի քիմիական հավելման յուրաքանչյուր փուլում օգտագործվում են բոլոր կամ որոշ պրեկուրսոր ամինաթթուների հավասարամոլային խառնուրդներ: Սինթեզի վերջնական փուլում պեպտիդները բաժանվում են կրիչից, այսինքն. դրանք վերածելով լուծելի ձևի: Պեպտիդային գրադարանների կառուցման երրորդ մոտեցումը, որը մենք այժմ նկարագրում ենք, իրագործելի դարձավ հենց գենետիկական ինժեներիայի մեթոդների մշակման շնորհիվ: Այն հիանալի կերպով ցույց է տալիս նման մեթոդների հնարավորությունները և, անկասկած, մեծ առաջընթաց է դրանց կիրառման մեջ: Այս առումով մենք ավելի մանրամասն կքննարկենք պեպտիդային գրադարանների օգտագործման արդյունքները սպիտակուցների էպիտոպների (հակագենային որոշիչներ) ուսումնասիրության մեջ:

Հիբրիդային սպիտակուցների արտադրության գենետիկական տեխնոլոգիան հնարավորություն է տվել մշակել կարճ պեպտիդների արտադրության արդյունավետ մեթոդ՝ դրանց կենսաբանական ակտիվությունը վերլուծելու համար: Ինչպես գենային գրադարանների դեպքում, գենետիկական ինժեներիայի մեթոդներով ստացված պեպտիդային գրադարանները ներկայացնում են կարճ պեպտիդների մեծ (հաճախ սպառիչ) հավաքածու: Երկու վերջին դիտարկումները հնարավորություն են տալիս դիտարկել պեպտիդների գրադարանը միաժամանակ և որպես սպիտակուցային էպիտոպների գրադարան: Նախ, կարճ պեպտիդները կարող են ներառել բոլոր էական ամինաթթուների մնացորդները, որոնք մեծ դեր են խաղում հակամարմինների փոխազդեցության մեջ, և նրանք կարող են ընդօրինակել սպիտակուցների մեծ հակագենային որոշիչները: Երկրորդ, շատ դեպքերում, ոչ կովալենտային կապերը, որոնք ձևավորվում են սպիտակուցային լիգանդների մի քանի կարևորագույն ամինաթթուների մնացորդների և նրանց ընկալիչների միջև, մեծ ներդրում ունեն լիգանդ-ընկալիչ փոխազդեցության ընդհանուր էներգիայի մեջ: Սա նկատի ունենալով, ցանկացած պեպտիդ կարելի է համարել պոտենցիալ լիգանդ, հեպտեն կամ ավելի մեծ պոլիպեպտիդների հակագենային որոշիչի մաս, իսկ ցանկացած պեպտիդային գրադարան կարելի է համարել սպիտակուցային էպիտոպների կամ պոտենցիալ լիգանդների գրադարան համապատասխան սպիտակուցային ընկալիչների համար:

Երրորդ մոտեցման արդյունքում ստացված պեպտիդային գրադարանն իր ժամանակակից ձևով տասնյակ կամ նույնիսկ հարյուր միլիոնավոր կարճ տարբեր ամինաթթուների հաջորդականությունների մի շարք է, որոնք արտահայտված են բակտերիոֆագի վիրուսների մակերեսի վրա՝ որպես սեփական մաս: կառուցվածքային սպիտակուցներ. Դա հնարավոր է դառնում հիբրիդային ռեկոմբինանտ գեների ներդրման շնորհիվ, որոնք կոդավորում են դրա վիրուսների փոփոխված կառուցվածքային սպիտակուցները բակտերիոֆագների գենոմում՝ գենետիկ ինժեներիայի մեթոդներով: (Այս մեթոդը հայտնի է որպես ֆագերի ցուցադրում): Նման գեների արտահայտման արդյունքում ձևավորվում են հիբրիդային սպիտակուցներ, որոնց N- կամ C-վերջիններում առկա են լրացուցիչ ամինաթթուների հաջորդականություններ:

Պեպտիդների և էպիտոպների գրադարանները նույնպես կգտնեն դրանց օգտագործումը հումորալ իմունային պատասխանի մեխանիզմների, ինչպես նաև իմունային համակարգի հիվանդությունների ուսումնասիրության մեջ: Մասնավորապես, աուտոիմուն հիվանդությունների մեծ մասն ուղեկցվում է սեփական օրգանիզմի անտիգենների դեմ աուտոհակամարմինների ձևավորմամբ: Այս հակամարմինները շատ դեպքերում ծառայում են որպես որոշակի աուտոիմուն հիվանդության հատուկ մարկերներ: Օգտագործելով էպիտոպների գրադարանը, սկզբունքորեն, հնարավոր է ձեռք բերել պեպտիդային մարկերներ, որոնց օգնությամբ հնարավոր կլինի վերահսկել աուտոհակամարմինների առանձնահատկությունը պաթոլոգիական գործընթացի զարգացման ընթացքում ինչպես առանձին օրգանիզմում, այնպես էլ հիվանդների խմբում: և, ի լրումն, որոշելու աուտոհակամարմինների առանձնահատկությունը անհայտ էթիոլոգիայի հիվանդությունների դեպքում:

Պեպտիդների և էպիտոպների գրադարանները կարող են նաև օգտագործվել իմունային շիճուկների զննման համար՝ բացահայտելու պեպտիդները, որոնք հատուկ փոխազդում են պաշտպանիչ հակամարմինների հետ: Նման պեպտիդները կկրկնօրինակեն պաթոգեն օրգանիզմների հակագենային որոշիչները և կծառայեն որպես մարմնի պաշտպանիչ հակամարմինների թիրախ: Սա թույլ կտա օգտագործել նման պեպտիդներ՝ համապատասխան պաթոգենների դեմ հակամարմիններ չունեցող հիվանդների պատվաստման համար: Պեպտիդային գրադարանների օգտագործմամբ էպիտոպների ուսումնասիրությունը հատուկ դեպք է դրանց օգտագործման բազմաթիվ ոլորտներից մեկի՝ լիգանդների և ընկալիչների փոխազդեցության կիրառական և հիմնարար ուսումնասիրություններում: Այս մոտեցման հետագա կատարելագործումը պետք է նպաստի կարճ պեպտիդների վրա հիմնված նոր դեղամիջոցների ստեղծմանը և օգտակար լինի սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցության մեխանիզմների հիմնարար ուսումնասիրություններում:

3.2 Զեկուցող սպիտակուցներ միաձուլման սպիտակուցներում

Մեկ այլ դեպքում, միաձուլման սպիտակուցները օգտագործվում են բակտերիալ բջիջներում կարճ պեպտիդների արտահայտման բարձր մակարդակներ ստանալու համար՝ կապված այս պեպտիդների կայունացման հետ միաձուլման սպիտակուցների ներսում: Հիբրիդային սպիտակուցները հաճախ օգտագործվում են դժվար հայտնաբերվող ռեկոմբինանտ սպիտակուցները հայտնաբերելու և մաքրելու համար: Օրինակ, գալակտոսիդազը ուսումնասիրվող սպիտակուցի C-տերմինալին որպես ռեպորտաժային սպիտակուց կցելով՝ հնարավոր է մաքրել ռեկոմբինանտ սպիտակուցը՝ հիմնվելով գալակտոզիդազային ակտիվության վրա՝ որոշելով դրա հակագենային որոշիչները իմունաքիմիական մեթոդներով: Բաց ընթերցման շրջանակներ (ORF) պարունակող ԴՆԹ-ի բեկորները զեկուցող սպիտակուցների գեների հետ համատեղելով՝ հնարավոր է մաքրել նման հիբրիդային սպիտակուցները՝ հիմնվելով ռեպորտաժային սպիտակուցի ակտիվության վրա և օգտագործել դրանք լաբորատոր կենդանիների իմունիզացիայի համար: Ստացված հակամարմիններն այնուհետև օգտագործվում են բնածին սպիտակուցը մաքրելու համար, որը ներառում է ORF-ով կոդավորված ռեկոմբինանտ պոլիպեպտիդը և դրանով իսկ նույնականացնում է կլոնավորված գենի հատվածը:

Հիբրիդային սպիտակուցների օգնությամբ լուծվում է նաև անհայտ գենի կլոնավորման հակադարձ խնդիրը, որի սպիտակուցային արտադրանքի նկատմամբ կան հակամարմիններ։ Այս դեպքում, նուկլեոտիդային հաջորդականությունների կլոնային գրադարանը, որը ներկայացնում է անհայտ գեների ORF-ները, կառուցվում է վեկտորներում, որոնք թույլ են տալիս ORF-ին կլոնավորել և միացնել ընթերցման նույն շրջանակում ռեպորտաժ գենի հետ: Այս ռեկոմբինանտ գեների արտահայտման արդյունքում ձևավորված հիբրիդային սպիտակուցները նույնացվում են հակամարմինների միջոցով՝ օգտագործելով ֆերմենտային իմունային վերլուծության մեթոդները: Հիբրիդային գեները, որոնք համատեղում են արտազատվող սպիտակուցները և ռեպորտաժային սպիտակուցները, հնարավորություն են տալիս նոր ձևերով ուսումնասիրել սեկրեցիայի մեխանիզմները, ինչպես նաև արտազատվող սպիտակուցների տեղայնացումը և տեղաշարժը հյուսվածքներում:

3.3 Սպիտակուցների ճարտարագիտության որոշ ձեռքբերումներ

1. Բակտերիոֆագ T4 լիզոզիմի մի քանի ամինաթթուների մնացորդները ցիստեինով փոխարինելով՝ ստացվել է մեծ քանակությամբ դիսուլֆիդային կապերով ֆերմենտ, որի շնորհիվ այս ֆերմենտը պահպանել է իր ակտիվությունը ավելի բարձր ջերմաստիճանում։

2. Escherichia coli-ի կողմից սինթեզված մարդու β-ինտերֆերոնի մոլեկուլում ցիստեինի մնացորդը սերինի մնացորդով փոխարինելը կանխեց միջմոլեկուլային բարդույթների ձևավորումը, ինչը նվազեցրեց այս դեղամիջոցի հակավիրուսային ակտիվությունը մոտավորապես 10 անգամ:

3. Թիրոսիլ-tRNA սինթետազ ֆերմենտի մոլեկուլում թրեոնինի մնացորդը պրոլինի մնացորդով փոխարինելը տասնապատկեց այս ֆերմենտի կատալիտիկ ակտիվությունը. այն սկսեց արագորեն կցել թիրոզինը tRNA-ին, որը թարգմանության ընթացքում փոխանցում է այս ամինաթթուն ռիբոսոմին:

4. Սուբտիլիսինները սերինով հարուստ ֆերմենտներ են, որոնք քայքայում են սպիտակուցները: Դրանք արտազատվում են բազմաթիվ բակտերիաների կողմից և լայնորեն օգտագործվում են մարդկանց կողմից կենսաքայքայման համար: Նրանք ամուր կապում են կալցիումի ատոմները՝ մեծացնելով դրանց կայունությունը։ Սակայն արդյունաբերական գործընթացներում կան քիմիական միացություններ, որոնք կապում են կալցիումը, որից հետո սուբտիլիսինները կորցնում են իրենց ակտիվությունը։ Գենը փոխելով՝ գիտնականները ֆերմենտից հեռացրել են ամինաթթուները, որոնք մասնակցում են կալցիումի կապակցմանը և փոխարինել մի ամինաթթուն մյուսով, որպեսզի բարձրացնեն սուբտիլիսինի կայունությունը: Ձևափոխված ֆերմենտը պարզվեց, որ կայուն և ֆունկցիոնալ ակտիվ է արդյունաբերականին մոտ պայմաններում։

5. Ցույց է տրվել այնպիսի ֆերմենտի ստեղծման հնարավորությունը, որը գործում է սահմանափակող ֆերմենտի նման, որը կտրում է ԴՆԹ-ն խիստ սահմանված վայրերում։ Գիտնականները ստեղծել են հիբրիդային սպիտակուց, որի մի հատվածը ճանաչում է նուկլեոտիդային մնացորդների որոշակի հաջորդականություն ԴՆԹ-ի մոլեկուլում, իսկ մյուսը՝ մասնատված ԴՆԹ-ն այս շրջանում:

6. Հյուսվածքային պլազմինոգենի ակտիվացնողը ֆերմենտ է, որը կլինիկականորեն օգտագործվում է արյան թրոմբները լուծելու համար: Ցավոք, այն արագորեն դուրս է գալիս շրջանառության համակարգից և պետք է կիրառվի բազմիցս կամ մեծ չափաբաժիններով, ինչը հանգեցնում է կողմնակի բարդությունների: Այս ֆերմենտի գենում երեք նպատակային մուտացիաներ ներմուծելով՝ մենք ստացանք երկարակյաց ֆերմենտ, որն ունի դեգրադացված ֆիբրինի նկատմամբ հարաբերակցություն և նույն ֆիբրինոլիտիկ ակտիվությամբ, ինչ սկզբնական ֆերմենտը:

7. Ինսուլինի մոլեկուլում մեկ ամինաթթու փոխարինելով՝ գիտնականները համոզվեցին, որ երբ այս հորմոնը ենթամաշկային կերպով ներարկվում է շաքարախտով հիվանդներին, արյան մեջ այս հորմոնի կոնցենտրացիայի փոփոխությունը մոտ է ֆիզիոլոգիականին, որը տեղի է ունենում ուտելուց հետո:

8. Գոյություն ունեն ինտերֆերոնների երեք դասեր, որոնք ունեն հակավիրուսային և հակաքաղցկեղային ակտիվություն, սակայն տարբեր առանձնահատկություններ են ցուցաբերում: Գայթակղիչ էր ստեղծել հիբրիդային ինտերֆերոն, որը կունենար երեք տեսակի ինտերֆերոնների հատկությունները: Ստեղծվել են հիբրիդային գեներ, որոնք ներառում էին մի քանի տեսակի բնական ինտերֆերոնի գեների բեկորներ։ Այս գեներից մի քանիսը, ինտեգրվելով բակտերիալ բջիջներին, ապահովում էին հիբրիդային ինտերֆերոնների սինթեզը ավելի մեծ հակաքաղցկեղային ակտիվությամբ, քան մայր մոլեկուլները:

9. Մարդու բնական աճի հորմոնը կապվում է ոչ միայն այս հորմոնի ընկալիչին, այլեւ մեկ այլ հորմոնի՝ պրոլակտինի ընկալիչին։ Բուժման ընթացքում անցանկալի կողմնակի ազդեցություններից խուսափելու համար գիտնականները որոշել են վերացնել պրոլակտինի ընկալիչին աճի հորմոնի միանալու հնարավորությունը։ Նրանք դրան հասել են՝ փոխարինելով աճի հորմոնի առաջնային կառուցվածքում որոշ ամինաթթուներ՝ օգտագործելով գենետիկական ճարտարագիտություն:

10. ՄԻԱՎ վարակի դեմ դեղամիջոցներ մշակելիս գիտնականները ստացան հիբրիդային սպիտակուց, որի մի հատվածն ապահովում էր այս սպիտակուցի հատուկ կապը միայն վիրուսով ախտահարված լիմֆոցիտների հետ, մեկ այլ հատված՝ հիբրիդային սպիտակուցի ներթափանցումը տուժած բջիջ, և մեկ այլ բեկոր խաթարել է սպիտակուցի սինթեզը տուժած բջիջում, ինչը հանգեցրել է նրա մահվան:

Դեղերի հիմնական թիրախը սպիտակուցներն են: Ներկայումս հայտնի է թմրամիջոցների գործողության շուրջ 500 թիրախ։ Առաջիկա տարիներին դրանց թիվը կհասնի 10000-ի, ինչը հնարավորություն կտա ստեղծել նոր, ավելի արդյունավետ և անվտանգ դեղամիջոցներ։ Վերջերս թմրամիջոցների հայտնաբերման սկզբունքորեն նոր մոտեցումներ են մշակվել. թիրախ են համարվում ոչ թե առանձին սպիտակուցները, այլ դրանց համալիրները, սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունը և սպիտակուցի ծալումը:

Եզրակացություն

սպիտակուցային ինժեներական մուտագենեզը փոփոխված է

Մատենագիտություն

1. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն.

2. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. Գենետիկայի առեղծվածները. /Վյաչեսլավ Մարկին // Գաղտնիքներ, հանելուկներ, փաստեր.

3. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. // Ռուսական մեծ հանրագիտարան.

4. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. // Քիմիկոս ձեռնարկ 21.

5. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն և դեղամիջոցների արդյունավետություն:

6. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. / Ա.Ի. Kornelyuk // Կենսապոլիմերներ և բջջային.

7. Սպիտակուցների ինժեներությունը կբարելավի դեղերի արդյունավետությունը: // Հանրաճանաչ մեխանիկա.

8. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. Ինսուլինի ընդունում: // Biofile - գիտական և տեղեկատվական ամսագիր:

9. Կենսատեխնոլոգիա. Հիմնական ուղղություններն ու ձեռքբերումները. // Կենսաբանություն դիմորդների և ուսուցիչների համար.

10. Բոգդանով Ա.Ա., Մեդնիկով Բ.Մ. Իշխանություն գենի վրա / A. A. Bogdanov, B. M. Մեդնիկով - Մ.: Կրթություն, 1989 - էջ 208

11. Գենետիկական ճարտարագիտություն. // Առողջություն.

12. Գեներ և քիմիկոսներ. // Գենետիկա.

13. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Սկզբունքներ և կիրառություն / B. Glick, J. Pasternak. - Մ.: Միր, 2002:

14. Գենային ինժեներիայի կիրառման այլ ոլորտներ: / Լ.Վ. Տիմոշենկոն, Մ.Վ. Չուբիկ // Բժշկություն - նորություններ և տեխնոլոգիաներ.

15. Եգորովա Տ.Ա., Կլունովա Ս.Մ., Ժիվուխին Է.Ա. Կենսատեխնոլոգիայի հիմունքները. / Թ.Ա. Եգորովա, Ս.Մ. Կլունովա, Է.Ա. Ժիվուխին - Մ., 2003:

16. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. // Քիմիա և կենսատեխնոլոգիա.

17. Պատրուշև Լ.Ի. Գենի արտահայտություն / L.I. Պատրուշև - Մ.: Նաուկա, 2000. - 496 էջ.

18. Պատրուշև Լ.Ի. Արհեստական գենետիկական համակարգեր. T. 1. Գենետիկ և սպիտակուցային ճարտարագիտություն: /Լ.Ի. Պատրուշև - Մ.: Նաուկա, 2004. - 526 էջ.

19. Ռիբչին Վ.Ն. Գենետիկական ճարտարագիտության հիմունքներ. Դասագիրք համալսարանների համար/Վ.Ն. Ռիբչին - Սանկտ Պետերբուրգ: Սանկտ Պետերբուրգի պետական տեխնիկական համալսարանի հրատարակչություն, 2002 թ. - 522 էջ.

20. Ստեփանով Վ.Մ. Մոլեկուլային կենսաբանություն. Սպիտակուցների կառուցվածքը և գործառույթները. / Վ.Մ. Ստեփանով - Մ.: Բարձրագույն դպրոց, 1996 թ.

21. Կենսատեխնոլոգիական տեխնոլոգիաներ՝ սպիտակուցային ճարտարագիտություն, նանոբիոտեխնոլոգիա, կենսասենսորներ և կենսաչիպեր: / Եվգենյա Ռյաբցևա // «Առևտրային կենսատեխնոլոգիա» - առցանց ամսագիր:

22. Չերնավսկի Դ.Ս., Չերնավսկայա Ն.Մ. Սպիտակուցը մեքենա է: Կենսաբանական մակրոմոլեկուլային կառուցվածքներ. / Դ.Ս. Չերնավսկի, Ն.Մ. Չերնավսկայա - Մ.: Մոսկվայի պետական համալսարանի հրատարակչություն, 1999 թ.

23. Schultz G.E., Schirmer R.H. Սպիտակուցների կառուցվածքային կազմակերպման սկզբունքները. / Գ.Ե. Շուլցը, Ռ.Հ. Շիրմեր - Մ.: Միր, 1982:

24. Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն 20 տարի շարունակ // Nature Reviews. Մոլեկուլային բջջային կենսաբանություն. 2002. Հատ. 3. Թիվ 12;

25. Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. // Վիքիպեդիա, ազատ հանրագիտարան։

Տեղադրված է Allbest.ru-ում

Նմանատիպ փաստաթղթեր

Գենային ինժեներիայի էությունն ու խնդիրները, դրա զարգացման պատմությունը: Գենետիկորեն ձևափոխված օրգանիզմների ստեղծման նպատակները. Քիմիական աղտոտումը ԳՁՕ-ների հետևանքով. Մարդու ինսուլինի ձեռքբերումը՝ որպես գենետիկորեն ձևափոխված օրգանիզմների ոլորտում կարևորագույն ձեռքբերում։

վերացական, ավելացվել է 18.04.2013թ

Կենսատեխնոլոգիայի առաջացումը. Կենսատեխնոլոգիայի հիմնական ուղղությունները. Կենսաէներգիան որպես կենսատեխնոլոգիայի ճյուղ։ Կենսատեխնոլոգիայի գործնական ձեռքբերումները. Գենային ինժեներիայի պատմություն. Գենետիկական ինժեներիայի նպատակները, մեթոդները և ֆերմենտները: Գենային ինժեներիայի ձեռքբերումները.

վերացական, ավելացվել է 23.07.2008թ

Բույսերի գենետիկական ինժեներիայի հնարավորությունները. Թունաքիմիկատների դիմացկուն բույսերի ստեղծում. Ֆոտոսինթեզի և կենսաբանական ազոտի ֆիքսման արդյունավետության բարձրացում: Պահպանման սպիտակուցների որակի բարելավում. Գենետիկական ինժեներիայի բնապահպանական, բժշկական և սոցիալ-տնտեսական ռիսկերը:

թեստ, ավելացվել է 15/12/2011

Գենային ինժեներիայի էությունը, տրանսգենային օրգանիզմների նույնականացման մեթոդները. ԳՁՕ-ների արտադրություն և տեխնոլոգիա, տարբերություն ավանդական բուծումից, առավելություններ և թերություններ. Աշխարհում գենետիկորեն ձևափոխված ապրանքների շուկայի վիճակը և զարգացման հեռանկարները.

դասընթացի աշխատանք, ավելացվել է 20.11.2010թ

Գենետիկական ճարտարագիտությունը կենսատեխնոլոգիայի մեթոդ է, որը զբաղվում է գենոտիպերի վերակազմավորման հետազոտություններով: Գենային ինժեներիայի հնարավորությունները. Գենային ինժեներիայի հեռանկարները. Գենետիկ տեխնոլոգիաների հետ կապված ռիսկի նվազեցում.

վերացական, ավելացվել է 09/04/2007 թ

Գենետիկական ճարտարագիտություն. ծագման պատմություն, ընդհանուր բնութագրեր, առավելություններ և թերություններ: Ծանոթացում գենետիկական ինժեներիայի նորագույն մեթոդներին և դրանց կիրառմանը բժշկության մեջ: Անասնաբուծության և թռչնաբուծության բնագավառում գենետիկական ինժեներիայի զարգացում. Փորձարկումներ առնետների վրա.

դասընթացի աշխատանք, ավելացվել է 07/11/2012 թ

Գենային ինժեներիայի տեխնիկայի հաջորդականությունը, որն օգտագործվում է գենետիկորեն ձևափոխված օրգանիզմներ ստեղծելու համար: ԴՆԹ-ի մասնատման համար օգտագործվող սահմանափակող ֆերմենտների հիմնական տեսակների դասակարգում. Ֆերմենտներ, որոնք սինթեզում են ԴՆԹ-ն ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի կաղապարի վրա:

շնորհանդես, ավելացվել է 27.04.2014թ

Գենետիկական և բջջային ճարտարագիտության էությունը. Բույսերի գենետիկ մոդիֆիկացիայի հիմնական խնդիրները, դրանց սպառման վնասակարության վերլուծությունը որպես սնունդ. Բուսական և կենդանական բջիջների հիբրիդացման առանձնահատկությունները. Գենային ինժեներիայի միջոցով բուժիչ նյութերի ստացման մեխանիզմը.

շնորհանդես, ավելացվել է 26.01.2014թ

դասընթացի աշխատանք, ավելացվել է 05/10/2011

ԴՆԹ-ի կլոնավորման հիմունքները և տեխնիկան. Բակտերիաների գենետիկական ինժեներիայի փուլերը. Բույսերի գենետիկական ինժեներիայի զարգացում: Ագրոբակտերիաների, գեների աղբյուրների օգտագործմամբ բույսերի գենետիկ փոխակերպում և բարելավում: Գենետիկորեն ձևափոխված բույսերի անվտանգություն.

Քիմիապես սպիտակուցը մոլեկուլի մեկ տեսակ է, որը պոլիամինաթթուների շղթա կամ պոլիմեր է։ Այն կազմված է 20 տեսակի ամինաթթուների հաջորդականություններից։ Մարդիկ, իմանալով սպիտակուցների կառուցվածքը, հարց տվեցին. հնարավո՞ր է ամինաթթուների բոլորովին նոր հաջորդականություններ նախագծել, որպեսզի նրանք կատարեն այն գործառույթները, որոնք անհրաժեշտ են մարդկանց, քան սովորական սպիտակուցները: Այս հանդուգն գաղափարի լավագույն անունն էր սպիտակուցային ճարտարագիտություն.

Ռոբոտը չի կարողացել ճշգրիտ վերարտադրել ամինաթթուների հաջորդականությունը, այսինքն՝ սխալներ է թույլ տվել։ Նա սինթեզեց մի շղթա մեկ հաջորդականությամբ, իսկ մյուսը՝ մի փոքր այլ: Բջջում մեկ սպիտակուցի բոլոր մոլեկուլները իդեալականորեն նման են միմյանց, այսինքն՝ դրանց հաջորդականությունը բացարձակապես նույնական է։

Եթե դուք ընտրում եք անհրաժեշտ հատկություններով մուտանտներ, ասենք, նրանք, ովքեր ավելի արդյունավետ կերպով մշակում են որոշակի սուբստրատ, ապա կարող եք այդպիսի մուտանտից առանձնացնել փոփոխված ֆերմենտը, որի շնորհիվ բջիջը ձեռք է բերում նոր հատկություններ: Բայց այս գործընթացը շատ երկար ժամանակ է պահանջում։

Այսպիսով, մենք կարող ենք եզրակացնել, որ գենետիկական ճարտարագիտությունը ճանապարհ է բացել դեպի սպիտակուցային ճարտարագիտություն իր ամենաարմատական ձևով: Օրինակ, մենք ընտրեցինք սպիտակուց և ցանկացանք փոխարինել դրա մեջ պարունակվող մի ամինաթթվի մնացորդը մյուսով:

Նախքան փոխարինման աշխատանքները սկսելը, դուք պետք է պատրաստեք ԴՆԹ վեկտոր: Սա վիրուսային կամ պլազմիդային ԴՆԹ է, որի մեջ ներկառուցված է մեզ հետաքրքրող սպիտակուցի գենը: Դուք նաև պետք է իմանաք գենի նուկլեոտիդային հաջորդականությունը և կոդավորված սպիտակուցի ամինաթթուների հաջորդականությունը: Վերջինը որոշվում է առաջինից՝ օգտագործելով գենետիկ կոդերի աղյուսակը:

Օգտագործելով աղյուսակը՝ նաև հեշտ է որոշել, թե ինչ նվազագույն փոփոխություններ պետք է կատարվեն գենի բաղադրության մեջ, որպեսզի այն սկսի կոդավորել ոչ թե բնօրինակը, այլ մեր խնդրանքով փոփոխված սպիտակուցը։ Եկեք ասենք, որ գենի մեջտեղում դուք պետք է փոխարինեք գուանինը թիմինով:

Նման փոքր բանի պատճառով ամբողջ գենը նորից սինթեզելու կարիք չկա։ Սինթեզվում է նուկլեոտիդների միայն մի փոքր հատված, որը լրացնում է այն շրջանը, որի մեջտեղում գտնվում է փոխարինման համար ընտրված գուանինի նուկլեոտիդը։

Ստացված բեկորը խառնվում է ԴՆԹ վեկտորի հետ (շրջանաձև ԴՆԹ), որը պարունակում է մեզ անհրաժեշտ գենը։ ԴՆԹ-ի օղակը և սինթեզված բեկորը ստեղծում են Ուոթսոն-Կրիքի կրկնակի պարույրի մի հատված։ Դրանում կենտրոնական զույգը «դուրս է մղվում» կրկնակի պարույրից, քանի որ այն ձևավորվում է փոխադարձաբար ոչ փոխլրացնող նուկլեոտիդներով։

Լուծույթին ավելացրեք չորս dNTP և ԴՆԹ պոլիմերազ: Վերջինս, օգտագործելով մեկ օղակի վրա կպած բեկորը, այն լրացնում է ամբողջական օղակի ամբողջականության սկզբունքին համապատասխան։

Արդյունքում մենք ստանում ենք գրեթե նորմալ վեկտորային ԴՆԹ: Այն կարող է ներմուծվել խմորիչ կամ բակտերիալ բջիջ՝ վերարտադրության համար: Միակ բանն այն է, որ այս ԴՆԹ-ն տարբերվում է սկզբնական վեկտորից ոչ կոմպլեմենտար զույգով։ Այլ կերպ ասած, ԴՆԹ-ի վեկտորի պարույրը լիովին կատարյալ չէ:

Ստացված վեկտորը այն կրող բակտերիաների հետ միասին կրկնապատկելու առաջին իսկ գործողության ժամանակ դուստր ԴՆԹ-ի մոլեկուլներից յուրաքանչյուրը կդառնա կատարյալ կրկնակի պարույր իր ողջ երկարությամբ: Սակայն դուստր մոլեկուլներից մեկը կրում է սկզբնական նուկլեոտիդային զույգը, իսկ մյուսը այս վայրում ունի մուտանտի վեկտոր, որի հիման վրա ստացվում է մեզ հետաքրքրող մուտանտային սպիտակուցը։

Այսպիսով, սպիտակուցային ճարտարագիտությունը ստեղծում է բջիջների խառնուրդ: Նրանցից ոմանք կրում են սկզբնական վեկտորը ոչ մուտանտ գենով, իսկ մյուս բջիջները կրում են մուտանտի գենը: Մնում է այս խառնուրդից ընտրել հենց այն բջիջները, որոնցում գտնվում է մուտանտի գենը.

Գենային ինժեներիայի մեթոդները, մասնավորապես առանձին գեների կամ դրանց մասերի կլոնավորումը, ինչպես նաև ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, հնարավորություն են տվել էապես բարելավել մուտագենեզի մեթոդոլոգիան՝ վերացնելով գենոմներում մուտացիաներ առաջացնելու դասական մեթոդների հիմնական թերությունները: Դասական գենետիկական վերլուծությունը ներառում է in vivo մուտագեն գործոնի ազդեցությունը ողջ գենոմի վրա, որի արդյունքում նրանում առաջանում են պատահական մուտացիաներ, հաճախ բազմակի, ինչը մեծապես բարդացնում է մուտանտների նույնականացումը։ Մուտանտ անհատները ճանաչվում են փոփոխված ֆենոտիպային բնութագրերով, և մուտացիայի բնույթը կարող է որոշվել ԴՆԹ-ի հաջորդականությունից հետո: Ժամանակակից տեղայնացված մուտագենեզը, ըստ էության, ներառում է հակադարձ գործողություններ՝ նախ հետաքրքրող գենը կամ դրա հատվածը կլոնավորվում է, նրա կառուցվածքը որոշվում է հաջորդականության ժամանակ, այնուհետև անհրաժեշտ փոփոխությունները կատարվում են դրա բաղադրության մեջ in vitro: Առաջացած մուտացիայի հետևանքները որոշվում են մուտանտի գենի սկզբնական օրգանիզմ ներմուծելուց հետո։

Տեղայնացված մուտագենեզի ամենապարզ տարբերակը բաղկացած է կլոնավորված ԴՆԹ-ի բեկորը մուտագեն գործոններից մեկով մշակելուց, սակայն նման ազդեցության արդյունքը կլինի նաև բեկորի կառուցվածքի պատահական փոփոխությունները: Տեղայնացված մուտագենեզի ավելի հուսալի և ավելի հաճախ օգտագործվող մեթոդներն իրականացվում են առանց մուտագեն գործոնների օգտագործման: Մուտացիաների տեսակներից գերակշռում են ջնջումները, ներդիրները և նուկլեոտիդային փոխարինումները։

Ջնջումներ.Այս տեսակի մուտացիաները տեղայնացված մուտագենեզում ստացվում են էնդոնուկլեազների միջոցով: Օգտագործվում են ինչպես սահմանափակող, այնպես էլ ոչ սպեցիֆիկ էնդոնուկլեազներ։ Սահմանափակող ֆերմենտների օգտագործման ամենապարզ դեպքը գենոմի ճեղքումն է սահմանափակող ֆերմենտի միջոցով, որը մի քանի ընդմիջում է կատարում՝ կպչուն ծայրեր ձևավորելու համար: Ստացված բեկորները կրկին փակվում են օղակի մեջ՝ օգտագործելով ԴՆԹ-ի լիգազը, ինչը կարող է հանգեցնել մոլեկուլների առաջացմանը, որոնք չեն պարունակում ԴՆԹ հատվածներից մեկը։ Այս մոտեցումը առաջացնում է լայնածավալ ջնջումներ և սովորաբար օգտագործվում է նախնական փորձերում՝ կլոնավորված ԴՆԹ-ի համեմատաբար մեծ հատվածների գործառույթը որոշելու համար:

Փոքր ջնջումները ստացվում են հետևյալ կերպ. Կլոնավորված բեկորը ճեղքվում է վեկտորի ներսում՝ համապատասխան տեղում՝ օգտագործելով սահմանափակող ֆերմենտ (նկ. 21.1): Ստացված գծային մոլեկուլը մշակվում է էկզոնուկլեազ III-ով, որը հիդրոլիզացնում է ԴՆԹ-ի մեկ շարանը,

սկսած 3' վերջից: Արդյունքը մոլեկուլների մի շարք է տարբեր երկարությունների միաշղթա 5' պոչերով: Այս պոչերը հիդրոլիզվում են ssDNA-ին հատուկ S1 նուկլեազով, և ԴՆԹ-ում ձևավորվում են ջնջումներ։ Կարող եք նաև օգտագործել էկզոնուկլեազ Bal 31, որը կատալիզացնում է երկու շղթաների դեգրադացիան՝ սկսած գծային ԴՆԹ մոլեկուլների ծայրերից։ Նուկլեոտիկ ռեակցիաների ընթացքը կարգավորվում է ինկուբացիոն ժամանակի, ջերմաստիճանի և ֆերմենտի կոնցենտրացիայի փոփոխությամբ՝ հրահրելով տարբեր երկարությունների ջնջումների ձևավորում։ Գծային ԴՆԹ-ի վերացման արդյունքում առաջացած տարբերակները հաճախ տրամադրվում են կապող սարքերով մինչև ցիկլացումը, որպեսզի սահմանափակման վայրերը ներկա լինեն ջնջման շրջանում: Կան նկարագրված մեթոդների այլ փոփոխություններ:

Ներդիրներ (ներդիրներ).Ներդիրներ ստանալու համար կլոնավորված ԴՆԹ-ն մարսվում է սահմանափակող ֆերմենտով կամ ոչ սպեցիֆիկ էնդոնուկլեազով, այնուհետև ստացված բեկորները կապվում են այն հատվածի առկայության դեպքում, որը ցանկանում են մտցնել ԴՆԹ: Ամենից հաճախ որպես այդպիսի հատվածներ օգտագործվում են քիմիապես սինթեզված պոլիլինկերներ (Գլուխ 20):

Ներդիրները, ինչպես ջնջումները, կարող են խաթարել գենի ամբողջականությունը կամ նրա կարգավորող շրջանների կառուցվածքը՝ հանգեցնելով թերի սպիտակուցի սինթեզին (ընդլայնված ջնջումների կամ շրջանակների տեղաշարժերի դեպքում, սովորաբար ոչ ակտիվ) կամ գենի տրանսկրիպցիոն գործընթացի փոփոխություններ։ հետաքրքրության. Այս կերպ հաճախ ձեռք են բերվում կարգավորող մուտանտներ և կառուցվում արտահայտման վեկտորներ (Գլուխ 20):

Կետային մուտացիաներ . Այս մուտացիաները նուկլեոտիդային փոխարինումներ են։ Դրանց ձեռքբերման համար կարելի է օգտագործել մի քանի մոտեցում՝ ցիտոզինային դեամինացիա, նուկլեոտիդային անալոգների ինկորպորացիա, նուկլեոտիդների սխալ ներածում բացերի վերականգնման ժամանակ և այլն։

Առաջին մեթոդը հիմնված է այն փաստի վրա, որ միաշղթա ԴՆԹ-ում ցիտոզինի մնացորդները կարող են դեամինացվել՝ առաջացնելով ուրացիլ՝ մշակելով բիսուլֆիտի իոններով: ԴՆԹ-ում միաշղթա շրջանները սովորաբար ստացվում են սահմանափակման վայրերի մոտ, օրինակ՝ էկզոնուկլեազ III-ի ազդեցությամբ: Բիսուլֆիտի մշակումից հետո միաշղթա բացերը լրացվում են ԴՆԹ պոլիմերազի միջոցով, իսկ ծայրերը կապվում են: Այն տեղամասերում, որտեղ ցիտիդիլատի փոխարեն ձևավորվել է ուրիդիլատ, ադենիլատը կզբաղեցնի կոմպլեմենտար դիրքը, և նման մոլեկուլի կրկնօրինակման ժամանակ GC զույգը կփոխարինվի AT զույգով:

Փոխարինումներ հրահրելու մեկ այլ մոտեցում է կլոնավորված ԴՆԹ-ի մշակումը սահմանափակող ֆերմենտով էթիդիումի բրոմիդի առկայության դեպքում, որը ներդնում է բազային զույգերի հարթությունների միջև և խաթարում է դուպլեքսի կառուցվածքը: Արդյունքում ձևավորվում է միայն միաշղթա ԴՆԹ-ի ընդմիջում։ Միաշղթայի ճեղքման վայրում փոքր բաց է ստեղծվում, այնուհետև վերականգնվում է ԴՆԹ պոլիմերազի, dATP, dGTP, dCTP և N-4-հիդրօքսիցիտոզին տրիֆոսֆատի առկայությամբ dTTP-ի փոխարեն: Թիմիդիլատի փոխարեն շղթայում ներառված է հիդրօքսիցիտոզին տրիֆոսֆատը, սակայն ԴՆԹ-ի վերարտադրության ժամանակ այն հավասարապես լավ է զուգակցվում ինչպես ադենիլատի, այնպես էլ գուանիլատի հետ: Կրկնօրինակման լրացուցիչ փուլից հետո գուանիլատի ընդգրկման արդյունքում AT→GC փոխարինումը տեղի կունենա այս վայրում (նկ. 21.2): Քանի որ այս մեթոդով նուկլեոտիդների փոխարինումը կատարվում է ներքին կարգով

սահմանափակման վայրում, հնարավոր է դառնում հեշտությամբ տարբերակել սկզբնական հաջորդականությամբ վեկտորները և մուտանտները: Դրա համար բավական է դրանք բուժել փորձի ժամանակ օգտագործված սահմանափակող ֆերմենտով. մուտանտի մոլեկուլները ճեղքման չեն ենթարկվի։

Նմանատիպ մեթոդը հիմնված է չորս հնարավոր նուկլեոտիդներից միայն երեքի օգտագործման վրա՝ ԴՆԹ պոլիմերազով միաշղթա բացը լրացնելիս: Շատ դեպքերում ֆերմենտը կանգ է առնում մոլեկուլի այն կետում, որտեղ առաջանում է բացակայող նուկլեոտիդը: Այնուամենայնիվ, երբեմն ԴՆԹ պոլիմերազը սխալվում է և միացնում ներկա երեք նուկլեոտիդներից մեկը: Սա հանգեցնում է օղակների մոլեկուլների առաջացմանը, որոնք պարունակում են չզույգված ոչ կոմպլեմենտար ազոտային հիմքեր։ Երբ նման վեկտորները ներմուծվում են բակտերիաների բջիջներ, որոշ մոլեկուլներ կվերականգնվեն նման վնասների: Արդյունքում, կրկնօրինակումից հետո մոլեկուլների կեսում կվերականգնվի սկզբնական հաջորդականությունը, իսկ մյուս կեսում կֆիքսվի մուտացիան։ Մուտանտի մոլեկուլները կարելի է տարբերել վերը նկարագրված մեթոդով:

Կայքի հատուկ մուտագենեզ: Տեղայնացված մուտագենեզի բնութագրվող մեթոդները տարբերվում են նրանով, որ այն վայրերը, որտեղ տեղի են ունենում մուտացիաներ, ընտրվում են պատահականորեն: Միևնույն ժամանակ, տեղային հատուկ մուտագենեզի տեխնիկան հնարավորություն է տալիս մուտացիաներ ներմուծել գենի հստակ սահմանված շրջան: Դա արվում է սինթետիկ (քիմիական սինթեզով ստացված) օլիգոնուկլեոտիդների միջոցով՝ տվյալ հաջորդականությամբ։ Մեթոդը հարմար է նրանով, որ այն չի պահանջում հարմար սահմանափակման վայրերի առկայությունը: Մեթոդը հիմնված է մուտացիա պարունակող սինթետիկ օլիգոնուկլեոտիդի և վեկտորում կոմպլեմենտար միաշղթա ԴՆԹ-ի միջև հեթերոդուպլեքսների ձևավորման վրա:

Շարունակեք հետևյալ կերպ. Սինթեզվում է փոքր օլիգոնուկլեոտիդ (8-20 մոնոմեր), որը լրացնում է գենի այն հատվածը, որտեղ նրանք ցանկանում են մուտացիա ստանալ։ Մեկ կամ մի քանի նուկլեոտիդային փոխարինումներ թույլատրվում են օլիգոնուկլեոտիդի կենտրոնական շրջանում: Ուսումնասիրվող գենը կամ դրա հատվածը կլոնավորվում է որպես M13 ֆագի վրա հիմնված վեկտորի մաս՝ շրջանաձև միաշղթա ռեկոմբինանտ ԴՆԹ ստանալու համար: Ռեկոմբինանտ վեկտորները խառնվում և զտվում են օլիգոնուկլեոտիդներով: Օլիգոնուկլեոտիդի հիբրիդացումը կոմպլեմենտար շրջանի հետ տեղի է ունենում, մինչդեռ ոչ կոմպլեմենտար նուկլեոտիդները մնում են չզույգված։ Օլիգոնուկլեոտիդը գործում է որպես այբբենարան պոլիմերազային ռեակցիայի մեջ, որը ներառում է ԴՆԹ պոլիմերազա in vitro: Օղակը փակված է լիգազներով։ Ստացված շրջանաձև մոլեկուլը ներմուծվում է E. coli բջիջների մեջ, որտեղ տեղի է ունենում մուտանտի վերարտադրման վայրերի մասնակի վերականգնում: Մուտացիաների հաճախականությունը սովորաբար տատանվում է 1-ից 50%: Մուտանտ ԴՆԹ-ի մոլեկուլներ պարունակող բջիջների ընտրությունը կարող է իրականացվել մի քանի եղանակով, որոնց թվում առավելությունն այն մեթոդն է, որն օգտագործում է ռադիոակտիվ պիտակավորված օլիգոնուկլեոտիդը, որն օգտագործվում է մուտագենեզի համար: Այս դեպքում այս նուկլեոտիդը ծառայում է որպես զոնդ։ Նման զոնդի օգտագործման սկզբունքը հիմնված է այն փաստի վրա, որ այն լիովին լրացնում է մուտանտ ԴՆԹ-ին և մասամբ լրացնում վայրի տիպի ԴՆԹ-ին: Հնարավոր է ընտրել այնպիսի հիբրիդացման պայմաններ (հիմնականում ջերմաստիճան), որ պիտակավորված զոնդի հիբրիդացումը կայուն լինի միայն մուտանտ ԴՆԹ-ի հաջորդականության հետ, որը կարող է հայտնաբերվել ավտոռադիոգրաֆիայի միջոցով:

Կայքի հատուկ մուտագենեզի մեթոդը հատկապես արժեքավոր է, քանի որ այն թույլ է տալիս մեկուսացնել մուտացիաները՝ չվերահսկելով դրանց ֆենոտիպային դրսևորումը: Այս մեթոդը նոր հնարավորություններ է բացում գենը կարգավորող տարրերի գործառույթների ուսումնասիրության համար, թույլ է տալիս փոխել պրոմոտորների «ուժը», օպտիմալացնել ռիբոսոմների կապման վայրերը և այլն: Այս մեթոդաբանության հիմնական կիրառություններից է. սպիտակուցային ճարտարագիտություն.

Սպիտակուցների ճարտարագիտություն. Այս արտահայտությունը նշանակում է մի շարք մեթոդաբանական տեխնիկա, որոնք հնարավորություն են տալիս վերակառուցել սպիտակուցի մոլեկուլը՝ նպատակաուղղված համապատասխան մուտացիաների ներդնելով կառուցվածքային գենի մեջ (տեղային հատուկ մուտագենեզ) և, հետևաբար, ամինաթթուների ցանկալի փոխարինումները սպիտակուցի առաջնային կառուցվածքում:

Ավելի ակտիվ սպիտակուցների կառուցման պատկերավոր օրինակ են Ֆերշտի և նրա գործընկերների փորձերը թիրոսիլ-tRNA սինթետազի ֆերմենտի հետ Bacillus stearothermophilus բակտերիայից: Այս ֆերմենտի ակտիվ վայրում ամինաթթուների փոխարինման հետևանքների վերլուծությունը հանգեցրեց այն եզրակացության, որ խմբերի հեռացումը, որոնք թույլ ջրածնային կապեր են կազմում սուբստրատի հետ, կարող է բարելավել դրա կապը սուբստրատի նկատմամբ: Պարզվել է, որ թրեոնին-51-ը (պեպտիդում զբաղեցնում է 51-րդ դիրքը) թիրոսիլադենիլատը կապելիս ստեղծում է երկար և թույլ ջրածնային կապ ռիբոզային օղակի թթվածնի հետ։ Միաժամանակ պարզվել է, որ պրոլինը նույն դիրքն է զբաղեցնում E. coli բակտերիաներում։ B.stearothermophilus tyrosyl-tRNA սինթետազի կառուցվածքը որոշող գենի տեղային մուտագենեզը հնարավորություն է տվել փոխարինել thr-51→pro -51պեպտիդում։ Արդյունքում, ATP-ի կապը ֆերմենտի ակտիվ կենտրոնում կտրուկ բարելավվել է, և նրա կատալիտիկ ակտիվությունը աճել է 25 անգամ։

Պրակտիկ նշանակություն ունեցող սպիտակուցների վերակառուցման մեկ այլ, ոչ պակաս նշանակալից օրինակ է Bacillus amyloliquefaciens-ից սուբտիլիսինի ձևափոխումը, որն իրականացվել է Էսթելի և այլոց կողմից: Սուբտիլիսինները սերինային պրոտեինազներ են, որոնք արտազատվում են բացիլների կողմից արտաքին միջավայր: Այս ֆերմենտները մեծ մասշտաբով արտադրվում են կենսատեխնոլոգիական արդյունաբերության կողմից և լայնորեն օգտագործվում են լվացող միջոցներում: Սուբտիլիսինների թերությունը պրոտեոլիտիկ ակտիվության կտրուկ նվազումն է օքսիդացնող նյութերի ազդեցության տակ, ներառյալ լվացքի փոշիներում պարունակվողները: BPN սուբտիլիսինի մոլեկուլի վերակառուցման նպատակն էր կայունացնել այն քիմիական օքսիդացման դեմ:

Նախնական փորձերում պարզվել է, որ ջրածնի պերօքսիդի առկայության դեպքում սուբտիլիսինը արագորեն նվազեցնում է ակտիվությունը մեթիոնին-222 մնացորդի օքսիդացման պատճառով, որը վերածվում է համապատասխան սուլֆօքսիդի։ Կայքի հատուկ մուտագենեզի մեթոդների կիրառմամբ՝ մեթիոնինի այս մնացորդը փոխարինվեց բոլոր մյուս 19 սպիտակուցային ամինաթթուներով: Մուտանտ գեներով պլազմիդները ներմուծվել են համապատասխան գեների ջնջումներով շտամների մեջ և վերլուծվել են արտադրված սուբտիլիսինների հատկությունները։ Սերինով և ալանին222-ով մուտանտները բավականին կայուն են պերօքսիդի ազդեցության նկատմամբ: Ամենաակտիվ մուտանտը ցիստեին-222 մնացորդ պարունակողն էր, որի սպեցիֆիկ ակտիվությունը 38%-ով ավելի բարձր էր, քան վայրի տիպի շտամինը:

Նման կերպ հնարավոր եղավ բարձրացնել բ-ինտերֆերոնի ակտիվությունը։ Սպիտակուցների ինժեներիայի այլ ձեռքբերումները ներառում են օնկոպրոտեինների փոխակերպող ակտիվության պարզաբանման ուսումնասիրությունները. փոխելով ֆերմենտների ջերմակայունությունը, օրինակ՝ ջերմակայուն ռենինի և ջերմակայուն ա-ամիլազի ստացում. բարձրացնելով համապատասխան պլազմային թաղանթային ընկալիչի կողմից ինսուլինին կապելու արդյունավետությունը՝ հորմոնի b-շղթայի 10-րդ դիրքում հիստիդինի ասպարտատով փոխարինելու պատճառով, ինչպես նաև բազմաթիվ այլ օրինակներ: Մեծ թվով սպիտակուցային ինժեներական արտադրանքներ արդեն գործնական կիրառություն են գտել արտադրական գործընթացներում:

1.1 Սպիտակուցների ճարտարագիտության հայեցակարգը: Զարգացման պատմություն

Նկար 1. Սխեման, թե ինչպես է աշխատում սպիտակուցային ճարտարագիտությունը:

Սպիտակուցների ճարտարագիտություն

Սպիտակուցների ինժեներական տեխնոլոգիան օգտագործվում է (հաճախ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ մեթոդի հետ համատեղ) գոյություն ունեցող սպիտակուցների (ֆերմենտներ, հակամարմիններ, բջջային ընկալիչներ) հատկությունները բարելավելու և բնության մեջ գոյություն չունեցող նոր սպիտակուցներ ստեղծելու համար։

Սպիտակուցների ճարտարագիտություն

Տեսակ և տեսակավորում

Արիստոտելն օգտագործել է «տեսակ» տերմինը նմանատիպ կենդանիներին նկարագրելու համար։ Դ.Ռեյի (1686թ.) և հատկապես Ք.Լիննեուսի (1751-1762թթ.) աշխատությունների ի հայտ գալուց հետո կենսաբանության մեջ հաստատապես հաստատվեց տեսակներ հասկացությունը որպես հիմնական...

Ավելի բարձր նյարդային ակտիվություն հասուն տարիքում

Ուղեղի աշխատանքը մարդկության համար երկար տարիներ մնում էր չբացահայտված առեղծված: Ոչ միայն հոգևորականները, այլև իդեալիզմ դավանող գիտնականները առեղծվածային հոգու հետ էին կապում մարմնի բոլոր մտավոր գործընթացները...

Գենետիկական ալգորիթմները իրական պարամետրերի օպտիմալացման հարցում

Այն, ինչ կոչվում է ստանդարտ գենետիկ ալգորիթմ, առաջին անգամ նկարագրվել և մանրամասն ուսումնասիրվել է դե Յոնգի աշխատության մեջ...

Գենային ինժեներիան

Գենետիկական ճարտարագիտությունը հայտնվեց կենսաքիմիայի և մոլեկուլային գենետիկայի տարբեր ճյուղերի բազմաթիվ հետազոտողների աշխատանքի շնորհիվ։ Երկար տարիներ սպիտակուցները համարվում էին մակրոմոլեկուլների հիմնական դասը։ Նույնիսկ ենթադրություն կար...

Գենային ինժեներիայի օգտագործումը հիվանդությունների բուժման և դեղամիջոցների ստեղծման մեջ

Գենետիկական ճարտարագիտությունը հայտնվել է կենսաքիմիայի և մոլեկուլային գենետիկայի տարբեր ճյուղերի բազմաթիվ հետազոտողների աշխատանքի շնորհիվ...

Գենետիկայի պատմություն

Չարլզ Դարվինի ուսմունքի համատարած տարածումից հետո առաջին քննադատներից մեկը, ով մատնանշեց տեսության թույլ կետը, շոտլանդացի հետազոտող Ֆ. Ջենքինսն էր։ 1867 թվականին նա նշել է, որ Դարվինի տեսության մեջ հստակություն չկար այն հարցի շուրջ...

Ժամանակակից տեխնոլոգիաների և էներգետիկայի զարգացման հայեցակարգեր

Ֆիզիկական աշխատանքը հեշտացնելու համար հնագույն ժամանակներից ստեղծվել են տարբեր սարքեր, մեխանիզմներ և մեքենաներ, որոնք ուժեղացնում են մարդու մեխանիկական հնարավորությունները: Բայց միայն մի քանի մեխանիզմներ են օգնել մարդուն աշխատանք կատարել...

Կլոնավորման առանձնահատկությունները

Հավերի ցեղերը և դրանց ժամանակակից տարածումը

Աշխարհի երկրների մեծ մասում թռչնաբուծությունը առաջատար դիրք է զբաղեցնում գյուղատնտեսական արտադրության այլ ճյուղերի շարքում՝ բնակչությանը ապահովելով բարձրարժեք դիետիկ սննդամթերքով (ձու, միս, համեղ ճարպային լյարդ)...

Մարդկության գոյության խնդիրը Վերնադսկու նոոսֆերայի տեսության լույսի ներքո

Բնական երևույթների դիտարկումների հիման վրա վաղուց առաջացել է այն միտքը, որ կենդանի էակները փոխազդում են արտաքին միջավայրի հետ և ազդում դրա փոփոխությունների վրա...

Ցիտոգենետիկան որպես գիտություն

Ցիտոգենետիկան գիտություն է ժառանգականության նյութական հիմքերի մասին։ Նա ուսումնասիրում է բջջի գենետիկական կառուցվածքների կառուցվածքի, վերարտադրության, ռեկոմբինացիայի, փոփոխությունների և գործունեության առանձնահատկությունները, դրանց բաշխումը միտոզում...

Օրգանիզմների խմբերի էվոլյուցիան

Էվոլյուցիոն տեսությունը կենդանի բնության պատմական զարգացման ընդհանուր օրինաչափությունների և շարժիչ ուժերի վարդապետությունն է։ Այս ուսուցման նպատակը՝ բացահայտել օրգանական աշխարհի զարգացման օրինաչափությունները՝ այս գործընթացի հետագա կառավարման համար...

Սպիտակուցների ճարտարագիտություն 6 Սպիտակուցների ուսումնասիրության և նոր հատկություններով սպիտակուցներ ստանալու մեթոդների և մոտեցումների մի շարք ՀԻՄՆԱԿԱՆ ԱՌԱՋԱԴՐԱՆՔՆԵՐ Ստեղծել նուկլեոտիդների և ամինաթթուների հաջորդականությունների կլոնային գրադարան Ուսումնասիրել ամինաթթուների մնացորդների մեկ փոխարինման ազդեցությունը սպիտակուցների ծալման և գործառույթների վրա Մշակել մեթոդներ արդյունավետ փոփոխման համար սպիտակուցներ՝ նրանց անհրաժեշտ հատկություններ տալու համար Մշակել մեթոդներ և մոտեցումներ պահանջվող հատկություններով սպիտակուցների զննման և ընտրության համար

Ռացիոնալ ձևավորում Ռացիոնալ ձևավորում Սպիտակուցի տարածական կազմակերպման մասին գիտելիքների անհրաժեշտություն Ներ և միջմոլեկուլային փոխազդեցությունների մասին գիտելիքների անհրաժեշտություն Մեթոդների և սարքավորումների անկատարությունը ուղղություն, որն ուղղված է նոր սպիտակուցների ստեղծմանը իրենց տարածական ձևավորման միջոցով:

Սպիտակուցի մոլեկուլների ուղղորդված էվոլյուցիան ուղղություն է, որն ուղղված է նոր սպիտակուցների ստեղծմանը ընտրության միջոցով 1՝ ստանալով պատահական ամինաթթուների հաջորդականությունների գրադարան 2՝ ընտրելով պոլիպեպտիդային շղթաներ, որոնք ունեն պահանջվող հատկությունների առնվազն փոքր աստիճան 3 օգտագործելով պատահական մուտագենեզը՝ ստանալով սպիտակուցների նոր գրադարան, որոնք օգտագործվում է ընտրության հաջորդ փուլում կամ նոր սպիտակուցներ արտահայտող գենետիկորեն մշակված կառուցվածքների կիրառմամբ

Սպիտակուցի մոլեկուլների ուղղորդված էվոլյուցիան (տարբերակներ) ռացիոնալ վերանախագծում՝ օգտագործելով ուղղորդված մուտագենեզ, փոխարինում է հատուկ ամինաթթուների մնացորդները սպիտակուցային մակերևույթների ֆերմենտային ինժեների ակտիվ կենտրոնում՝ օգտագործելով մուտացիաները, փոխում են պոլիպեպտիդային շղթայի հատվածները ամինաթթուների մնացորդների մոտակայքում, որոնք մոտ են միմյանց: սպիտակուցի գլոբուլի մակերեսը, բայց գտնվում է պոլիպեպտիդային շղթայում զգալի հեռավորության վրա՝ միմյանցից հեռու

Նշված հատկություններով սպիտակուցների զննում և ընտրություն. պատահական սքրինինգ, բարելավված զննման ընտրություն, յուրաքանչյուր սպիտակուց հետազոտվում է պահանջվող հատկությունների առկայության համար. գրադարանից սպիտակուցների ընտրությունը տեղի է ունենում պատահականորեն, յուրաքանչյուր սպիտակուց հետազոտվում է պահանջվող հատկությունների առկայության համար. գրադարանից սպիտակուցների ընտրությունը տեղի է ունենում պատահականորեն. դա հնարավոր է, եթե գրադարանը կազմող առարկաները տարբերվում են ֆենոտիպիկ կերպով (օրինակ՝ ֆերմենտային ակտիվության առկայության դեպքում), պայմաններ են ստեղծվում գրադարանի այն բաղադրիչների ընտրովի պահպանման համար, որոնք ունեն որոշակի հատկություններ (ֆագ, բջիջների ցուցադրում); պայմաններ են ստեղծվում գրադարանի բաղադրիչների ընտրովի պահպանման համար. արդյունքում ստացված կլոնային գրադարանը

Ֆագի ցուցադրում Նպատակը ֆագի մակերեսին օտար սպիտակուցներ ցուցադրելն է:Մեթոդը մշակվել է 1985 թվականին M13 թելիկ բակտերիոֆագի համար: (pIII և pVIII գեները հարմար թիրախային տեղամասեր են օտար cDNA բեկորների տեղադրման համար) Նպատակը ֆագի մակերեսին օտար սպիտակուցների բացահայտումն է:Մեթոդը մշակվել է 1985թ.-ին թելիկ M13 բակտերիոֆագի համար: (pIII և pVIII գեները հարմար թիրախային տեղամասեր են օտար cDNA բեկորների տեղադրման համար) կառուցվում է հիբրիդային գեն, որը բաղկացած է թիրախային սպիտակուցի կոդավորող հաջորդականություններից և բակտերիոֆագի կողմից ֆագի ծածկույթի սպիտակուցներից մեկից, E. coli-ն վարակվում է ֆագի ժամանակ: հավաքում; հիբրիդային սպիտակուցները ներառված են ֆագի մասնիկի մեջ

Phagmid Helper phage Phage genome E.coli-ի վարակը օգնական ֆագով E.coli-ի բջիջները, որոնք փոխակերպվել են պլազմիդային գրադարանով/ֆագեմիդով, վարակվում են օգնական ֆագով՝ ստանալով ֆագի մասնիկներ, որոնց մակերեսին ենթարկվում են թիրախային սպիտակուցի տարբեր տարբերակներ E. coli բջիջները, որոնք փոխակերպվում են պլազմիդային գրադարանով / ֆագեմիդով, վարակվում են օգնական ֆագով` ֆագային մասնիկներ ստանալու համար, որոնց մակերեսին ենթարկվում են թիրախային սպիտակուցի տարբեր տարբերակներ:

Սպիտակուցային ճարտարագիտության գործնական կիրառման հեռանկարները Բժշկություն. *նոր դեղերի արտադրության համար; ախտորոշիչ գործիքների ստեղծման և պատվաստանյութերի արտադրության համար. *Իմուն պատասխանի մեխանիզմների, ինչպես նաև իմունային համակարգի հիվանդությունների ուսումնասիրության համար Էկոլոգիա. *ախտորոշման և շրջակա միջավայրի մոնիտորինգի համար բիոսենսորներ ստանալու համար. *բիոադսորբենտների ստեղծման համար՝ շրջակա միջավայրից թունավոր նյութերը և ծանր մետաղների իոնները հեռացնելու համար

Գլյուկոզայի չափումը ֆերմենտային էլեկտրոդի միջոցով (Լ. Քլարկի փորձի սխեմատիկ ներկայացում): Գլյուկոզայի օքսիդացում գլյուկոզա օքսիդազ ֆերմենտի միջոցով թթվածնի առկայությամբ՝ գլյուկոզա + O 2 H 2 O 2 + գլյուկոնո-1,5-լակտոն։ H 2 O 2-ը կրճատվում է պլատինե էլեկտրոդի վրա +700 մՎ պոտենցիալով; Շղթայում հոսող հոսանքը համաչափ է ջրածնի պերօքսիդի (այսինքն՝ անուղղակիորեն՝ գլյուկոզայի) կոնցենտրացիայի հետ։