Методи на генетски инженеринг за производство на протеини. Нови генетски конструирани протеини базирани на рекомбинантни антитела против ТНФ Ефимов Григориј Александрович. Проучување на биолошките својства на флуоресцентниот сензор Vhh41-KTNFin витро и ин виво

Испратете ја вашата добра работа во базата на знаење е едноставна. Користете ја формата подолу

Студентите, дипломираните студенти, младите научници кои ја користат базата на знаење во нивните студии и работа ќе ви бидат многу благодарни.

Објавено на http://www.allbest.ru/

Работа на курсот

дисциплина: Земјоделска биотехнологија

на тема: „Инженерство на протеини“

Есеј
Вовед
I. Протеинско инженерство

1.1 Концептот на протеинско инженерство. Историја на развој

II. Примери на инженерски протеини

3.3 Некои достигнувања на протеинско инженерство.

Заклучок
Библиографија

Тема: Протеинско инженерство.

Клучни зборови: биотехнологија, генетски инженеринг, протеин, генетски код, ген, ДНК, РНК, АТП, пептиди, епитоп.

Целта на предметната работа: да се проучи концептот на „протеинско инженерство“ и потенцијалните можности за негова употреба.

Потенцијални можности за инженерство на протеини:

1. Со промена на јачината на врзување на супстанцијата што се претвора - супстратот - за ензимот, можно е да се зголеми вкупната каталитичка ефикасност на ензимската реакција.

2. Со зголемување на стабилноста на протеинот на широк опсег на температури и киселост, тој може да се користи во услови под кои оригиналниот протеин се денатурира и ја губи својата активност.

3. Со создавање на протеини кои можат да функционираат во безводни растворувачи, можно е да се спроведат каталитички реакции под нефизиолошки услови.

4. Со промена на каталитичкиот центар на ензимот, можете да ја зголемите неговата специфичност и да го намалите бројот на несакани несакани реакции

5. Со зголемување на отпорноста на протеинот кон ензимите кои го разградуваат, постапката за негово прочистување може да се поедностави.

6. Со менување на протеинот за да може да функционира без неговата вообичаена компонента што не е аминокиселина (витамин, метален атом итн.), може да се користи во некои континуирани технолошки процеси.

7. Со промена на структурата на регулаторните делови на ензимот, можно е да се намали степенот на неговата инхибиција од производот на ензимската реакција според видот на негативните повратни информации и со тоа да се зголеми приносот на производот.

8. Можно е да се создаде хибриден протеин кој има функции на два или повеќе протеини.

9. Можно е да се создаде хибриден протеин, чиј еден од деловите го олеснува ослободувањето на хибридниот протеин од култивираната клетка или неговото извлекување од смесата.

Вовед

Од памтивек, биотехнологијата се користи главно во прехранбената и лесната индустрија: во винарството, пекарството, ферментацијата на млечни производи, во преработката на лен и кожа, врз основа на употреба на микроорганизми. Во последните децении, можностите на биотехнологијата енормно се проширија. Ова се должи на фактот што неговите методи се попрофитабилни од конвенционалните од едноставна причина што кај живите организми, биохемиските реакции катализирани од ензими се случуваат под оптимални услови (температура и притисок), се попродуктивни, еколошки и не бараат хемиски реагенси кои ја трујат околината.

Предметите на биотехнологијата се бројни претставници на групи живи организми - микроорганизми (вируси, бактерии, протозои, квасци), растенија, животни, како и клетки изолирани од нив и субклеточни компоненти (органели), па дури и ензими. Биотехнологијата се заснова на физиолошки и биохемиски процеси кои се случуваат во живите системи, што резултира со ослободување на енергија, синтеза и разградување на метаболичките производи и формирање на хемиски и структурни компоненти на клетката.

Главниот правец на биотехнологијата е производство, со користење на микроорганизми и култивирани еукариотски клетки, на биолошки активни соединенија (ензими, витамини, хормони), лекови (антибиотици, вакцини, серуми, високоспецифични антитела итн.), како и вредни соединенија ( адитиви за добиточна храна, на пример, есенцијални амино киселини, протеини за добиточна храна итн.).

Методите на генетски инженеринг овозможија да се синтетизираат во индустриски количини хормони како што се инсулин и соматотропин (хормон за раст), кои се неопходни за лекување на човечки генетски болести.

Биотехнологијата решава не само специфични проблеми на науката и производството. Таа има поглобална методолошка задача - ја проширува и забрзува скалата на човечкото влијание врз живата природа и промовира адаптација на живите системи на условите на човековото постоење, т.е. кон ноосферата. Така, биотехнологијата делува како моќен фактор во антропогената адаптивна еволуција.

Биотехнологијата, генетското и клеточното инженерство имаат ветувачки изгледи. Како што се појавуваат се повеќе нови вектори, луѓето ќе ги користат за да ги воведат потребните гени во клетките на растенијата, животните и луѓето. Ова ќе овозможи постепено ослободување од многу наследни човечки болести, ќе ги принуди клетките да ги синтетизираат потребните лекови и биолошки активни соединенија, а потоа директно протеините и есенцијалните амино киселини што се користат во храната. Користејќи методи кои веќе ги совладала природата, биотехнолозите се надеваат дека ќе добијат водород преку фотосинтеза - најеколошки гориво на иднината, електрична енергија и ќе го претворат атмосферскиот азот во амонијак во нормални услови.

Физичките и хемиските својства на природните протеини често не ги задоволуваат условите под кои овие протеини ќе ги користат луѓето. Потребна е промена во неговата примарна структура, што ќе обезбеди формирање на протеин со различна просторна структура од претходно и нови физичко-хемиски својства, овозможувајќи му да ги извршува функциите својствени за природниот протеин под други услови. Протеинското инженерство се занимава со изградба на протеини.

Друга област на примена на инженерството на протеини е создавањето на протеини кои можат да ги неутрализираат супстанциите и микроорганизмите кои можат да се користат за хемиски и биолошки напади. На пример, ензимите на хидролаза се способни да ги неутрализираат и нервните гасови и пестицидите кои се користат во земјоделството. Покрај тоа, производството, складирањето и употребата на ензими не е опасно за животната средина и здравјето на луѓето.

За да се добие изменет протеин, се користат методи на комбинаторна хемија и се спроведува насочена мутагенеза - воведувајќи специфични промени во кодираните секвенци на ДНК, што доведува до одредени промени во секвенците на аминокиселините. За ефикасно дизајнирање протеин со посакуваните својства, неопходно е да се знаат моделите на формирање на просторната структура на протеинот, од кои зависат неговите физичко-хемиски својства и функции, односно, неопходно е да се знае како е примарната структура на протеинот , секој од неговите аминокиселински остатоци влијае на својствата и функциите на протеинот. За жал, за повеќето протеини терциерната структура е непозната; не е секогаш познато која аминокиселина или низа од аминокиселини треба да се сменат за да се добие протеин со саканите својства. Веќе сега, научниците кои користат компјутерска анализа можат да ги предвидат својствата на многу протеини врз основа на секвенцата на нивните аминокиселински остатоци. Ваквата анализа во голема мера ќе ја поедностави постапката за создавање на саканите протеини. Во меѓувреме, за да се добие модифициран протеин со посакуваните својства, тие главно одат на поинаков начин: добиваат неколку мутантни гени и го наоѓаат протеинскиот производ на еден од нив кој ги има посакуваните својства.

Различни експериментални пристапи се користат за мутагенеза насочена кон локацијата. Откако го доби модифицираниот ген, тој се интегрира во генетски конструкт и се внесува во прокариотски или еукариотски клетки кои го синтетизираат протеинот кодиран од овој генетски конструкт.

I. Протеинско инженерство

1.1 Концептот на протеинско инженерство. Историја на развој

Протеинско инженерство е гранка на биотехнологијата која се занимава со развој на корисни или вредни протеини. Ова е релативно нова дисциплина која се фокусира на проучување на виткањето на протеините и принципите на модификација и создавање на протеини.

Постојат две главни стратегии за протеинско инженерство: насочена модификација на протеините и насочена еволуција. Овие методи не се исклучуваат меѓусебно; истражувачите често ги користат и двете. Во иднина, подетално познавање на структурата и функцијата на протеините, како и напредокот во високата технологија, може значително да ги прошират можностите за протеинско инженерство. Како резултат на тоа, дури и неприродни амино киселини може да се вградат благодарение на новиот метод кој овозможува нови аминокиселини да се вградат во генетскиот код.

Протеинското инженерство потекнува од пресекот на протеинската физика и хемија и генетскиот инженеринг. Го решава проблемот со создавање на модифицирани или хибридни протеински молекули со одредени карактеристики. Природен начин за спроведување на таква задача е да се предвиди структурата на генот што го кодира изменетиот протеин, да се изврши неговата синтеза, клонирање и изразување во клетките приматели.

Првата контролирана модификација на протеини беше спроведена во средината на 60-тите од страна на Кошланд и Бендер. За да ја заменат хидроксилната група со сулфхидрилна група во активниот центар на протеазата, субтилизин, користеле метод на хемиска модификација. Сепак, како што се испостави, таквиот тиолсубтилизин не ја задржува активноста на протеазата.

Хемиски, протеинот е единствен тип на молекула, кој е синџир на полиамино киселина или полимер. Составен е од секвенци на аминокиселини од 20 типа. Откако ја научија структурата на протеините, луѓето го поставија прашањето: дали е можно да се дизајнираат целосно нови секвенци на аминокиселини за да ги извршуваат функциите што им се потребни на луѓето многу подобро од обичните протеини? Името Protein Engineering беше соодветно за оваа идеја.

Луѓето почнаа да размислуваат за такво инженерство уште во 50-тите години на 20 век. Ова се случи веднаш по дешифрирањето на првите протеински аминокиселински секвенци. Во многу лаборатории ширум светот, направени се обиди да се дуплираат природата и хемиски да се синтетизираат дадени апсолутно произволни полиамино киселински секвенци.

Во тоа најмногу успеал хемичарот Б. Мерифилд. Овој Американец успеа да развие исклучително ефикасен метод за синтеза на синџири на полиамино киселини. За ова, Мерифилд ја доби Нобеловата награда за хемија во 1984 година.

Слика 1. Шема за тоа како функционира инженерството на протеини.

Американецот почна да синтетизира кратки пептиди, вклучително и хормони. Во исто време, тој изгради автомат - „хемиски робот“ - чија задача беше да произведува вештачки протеини. Роботот предизвика сензација во научните кругови. Сепак, набрзо стана јасно дека неговите производи не можат да се натпреваруваат со она што го произведува природата.

Роботот не можел точно да ги репродуцира секвенците на аминокиселините, односно направил грешки. Тој синтетизирал еден синџир со една низа, а другиот со малку изменета. Во една клетка, сите молекули на еден протеин се идеално слични едни на други, односно нивните секвенци се апсолутно идентични.

Имаше друг проблем. Дури и оние молекули кои роботот правилно ги синтетизирал не ја добиле просторната форма неопходна за функционирање на ензимот. Така, обидот да се замени природата со вообичаените методи на органска хемија доведе до многу скромен успех.

Научниците можеа само да учат од природата, барајќи ги потребните модификации на протеините. Поентата овде е дека во природата постојано има мутации што доведуваат до промени во аминокиселинските секвенци на протеините. Ако изберете мутанти со потребните својства кои поефикасно обработуваат одредена супстрат, тогаш можете да изолирате од таков мутант изменет ензим, благодарение на што клетката стекнува нови својства. Но, овој процес трае многу долг временски период.

Сè се промени кога се појави генетскиот инженеринг. Благодарение на неа, тие почнаа да создаваат вештачки гени со која било нуклеотидна секвенца. Овие гени беа вметнати во подготвени векторски молекули и ДНК беше внесена во бактерии или квасец. Таму е земена копија на РНК од вештачкиот ген. Како резултат на тоа, се произведе потребниот протеин. Грешките во неговата синтеза беа исклучени. Главната работа беше да се избере вистинската секвенца на ДНК, а потоа самиот ензимски систем на клетката ја заврши својата работа беспрекорно. Така, можеме да заклучиме дека генетскиот инженеринг го отвори патот кон инженерството на протеини во неговата најрадикална форма.

1.2 Стратегии за инженерство на протеини

Целна модификација на протеини. Во таргетираната модификација на протеините, научникот користи детално познавање на структурата и функцијата на протеинот за да ги направи саканите промени. Општо земено, овој метод има предност што е ефтин и технички некомплициран, бидејќи техниката на мутагенеза насочена кон локацијата е добро развиена. Сепак, неговиот главен недостаток е тоа што често недостасуваат информации за деталната структура на протеинот, па дури и кога структурата е позната, може да биде многу тешко да се предвиди ефектот на различни мутации.

Софтверските алгоритми за модификација на протеини се стремат да идентификуваат нови секвенци на аминокиселини кои бараат малку енергија за да формираат однапред дефинирана целна структура. Иако низата што мора да се најде е голема, најтешкиот услов за модификација на протеините е брз, но сепак прецизен начин да се идентификува и дефинира оптималната низа, наспроти сличните неоптимални секвенци.

Насочена еволуција. Во насочената еволуција, случајната мутагенеза се применува на протеин и се врши избор за да се изберат варијанти кои имаат одредени квалитети. Следно, се применуваат повеќе кругови на мутација и селекција. Овој метод ја имитира природната еволуција и генерално дава супериорни резултати за насочена модификација.

Дополнителна техника позната како мешање на ДНК меша и идентификува делови од успешни варијанти за да произведе подобри резултати. Овој процес ги имитира рекомбинациите што се случуваат природно за време на сексуалната репродукција. Предноста на насочената еволуција е тоа што не бара претходно познавање на структурата на протеините, ниту пак е неопходно да може да се предвиди каков ефект ќе има дадената мутација. Навистина, резултатите од експериментите со насочена еволуција се изненадувачки бидејќи посакуваните промени често се предизвикани од мутации кои не треба да имаат таков ефект. Недостаток е што овој метод бара висока пропусност, што не е можно за сите протеини. Големи количини на рекомбинантна ДНК мора да се мутираат и производите мора да се прегледаат за посакуваниот квалитет. Огромниот број на опции често бара купување на роботика за автоматизирање на процесот. Покрај тоа, не е секогаш лесно да се проверат сите квалитети од интерес.

II. Примери на инженерски протеини

Протеинското инженерство може да се заснова на хемиска модификација на готов протеин или на методи на генетско инженерство што овозможуваат да се добијат модифицирани верзии на природни протеини.

Дизајнот на специфичен биолошки катализатор се врши земајќи ги предвид и специфичноста на протеинот и каталитичката активност на органометалниот комплекс. Еве примери на таква модификација извршена за да се добијат „полу-синтетички биооргански комплекси“. Миоглобинот на сперматозоидниот кит е способен да го врзува кислородот, но нема бикаталитичка активност. Како резултат на комбинацијата на оваа биомолекула со три комплекси за пренос на електрони кои содржат рутениум, кои се врзуваат за остатоците од хистидин на површината на протеинските молекули, се формира комплекс кој е способен да го намалува кислородот додека истовремено оксидира голем број органски супстрати, како што се како аскорбат, со брзина речиси иста како и за природната аскорбат оксидаза. Во принцип, протеините може да се модифицираат на други начини. Размислете за папаинот, на пример. Тој е еден од добро проучените протеолитички ензими за кои е одредена тродимензионална структура. Во близина на остатокот на цистеин-25 на површината на протеинската молекула постои продолжен жлеб во кој се јавува реакцијата на протеолиза. Оваа локација може да се алкилира со дериват на флавин без промена на пристапноста на потенцијалното место за врзување на подлогата. Ваквите модифицирани флавопапаини биле користени за оксидација на М-алкил-1,4-дихидроникотинамиди, а каталитичката активност на некои од овие модифицирани протеини била значително повисока од онаа на природните флавопротеин-NADH дехидрогенази. Така, беше можно да се создаде многу ефикасен полусинтетички ензим. Употребата на флавини со високо активни, позиционирани супституенти за повлекување електрони може да овозможи да се развијат ефективни катализатори за намалување на никотин амид.

Големиот напредок постигнат неодамна во хемиската синтеза на ДНК отвори фундаментално нови можности за протеинско инженерство: дизајн на уникатни протеини кои не се појавуваат во природата. Ова бара понатамошен развој на технологијата, така што менувањето на гените со помош на методите на генетски инженеринг доведува до предвидливи промени во протеините, до подобрување на нивните добро дефинирани функционални карактеристики: број на обрт, Km за специфичен супстрат, термичка стабилност, температурен оптимум, стабилност и активност во неводени растворувачи, специфичност на подлогата и реакцијата, потребата за кофактори, pH оптимална, отпорност на протеаза, алостерична регулација, молекуларна тежина и структура на подединица. Типично, таквото подобрување е постигнато преку мутагенеза и селекција, а во поново време преку хемиска модификација и имобилизација. За успешно дизајнирање на специфичен тип на протеинска молекула, неопходно е да се идентификуваат голем број основни обрасци кои ги поврзуваат структурните карактеристики на протеините и нивните посакувани својства. Така, знаејќи ја точната кристалната структура на протеинската молекула што се проучува, можно е да се идентификуваат оние делови од него што треба конкретно да се модифицираат за да се зголеми неговата каталитичка активност. Таквата модификација може да се состои од промена на амино киселинската секвенца на протеинот.

Друг пример е имплементацијата на мутагенеза специфична за локацијата. Тоа се случува на следниов начин. Генот за протеинот што го интересира истражувачот се клонира и се вметнува во соодветен генетски носач. Потоа се синтетизира олигонуклеотиден прајмер со саканата мутација, чија низа, составена од десет до петнаесет нуклеотиди, е доволно хомологна за одреден регион на природниот ген и затоа е способна да формира хибридна структура со него. Овој синтетички прајмер се користи од полимеразите за да се иницира синтеза на комплементарна копија на векторот, која потоа се одвојува од оригиналот и се користи за контролирана синтеза на мутантниот протеин. Алтернативен пристап се заснова на расцепување на синџирот, отстранување на местото што треба да се промени и негова замена со синтетички аналог со саканата нуклеотидна секвенца.

Тирозил-tRNA синтетаза ја катализира реакцијата на аминоацилација на тирозин tRNA, која вклучува активирање на тирозин од страна на АТП за да се формира тирозил аденилат. Генот за овој ензим, изолиран од Bacillus stearothermophilus, бил вметнат во бактериофагот М13. Каталитичките својства на ензимот, особено неговата способност да го врзува супстратот, потоа беа променети со модификација специфична за локацијата. Така, треонин-51 беше заменет со аланин. Ова резултираше со двојно зголемување на врзувањето на подлогата, очигледно поради неможноста да се формира водородна врска помеѓу овој остаток и тирозил аденилат. При замена на аланин со пролин, конфигурацијата на молекулата на ензимот е нарушена, но способноста за врзување на подлогата се зголемува стократно, бидејќи нејзината интеракција со хистидин-48 е олеснета. Слични промени специфични за локацијата се добиени во β-лактамазата, и тие обично се придружени со инактивација на ензимот. Замената на серин-70 со цистеин доведува до формирање на p-тиол лактамаза, чија константа на врзување не се разликува од онаа на природниот ензим, но активноста кон пеницилин е само 1-2%. Сепак, активноста на овој мутантен ензим против некои активирани цефалоспорини не е помала од првобитната активност, па дури и ја надминува; овие протеини се исто така поотпорни на протеазите.

Сега се користат мутации специфични за локацијата за тестирање на адекватноста на структурните студии. Во некои случаи, тие можеа да покажат дека структурната стабилност на протеинот и неговата каталитичка активност може да се одвојат. Доволно количество информации се акумулирале за односот помеѓу стабилноста на структурата на протеините и неговата функција; можеби ќе можеме фино да ја прилагодиме активноста на биолошките катализатори и да создадеме целосно синтетички аналози на нив. Неодамна, се појави работа која го објави клонирањето на првиот синтетички ензимски ген кој го кодира активниот фрагмент од молекулата на рибонуклеазата.

III. Апликации на протеинско инженерство

Технологијата за инженерство на протеини се користи (често во комбинација со методот на рекомбинантна ДНК) за подобрување на својствата на постоечките протеини (ензими, антитела, клеточни рецептори) и создавање на нови протеини кои не постојат во природата. Таквите протеини се користат за создавање лекови, во преработката на храна и во индустриското производство.

Во моментов, најпопуларната примена на инженерството на протеини е да се модифицираат каталитичките својства на ензимите за да се развијат „еколошки“ индустриски процеси. Од еколошка гледна точка, ензимите се најприфатливи од сите катализатори што се користат во индустријата. Ова е обезбедено со способноста на биокатализаторите да се раствораат во вода и целосно да функционираат во средина со неутрална pH вредност и на релативно ниски температури. Покрај тоа, поради нивната висока специфичност, употребата на биокатализатори резултира со многу малку несакани производствени нуспроизводи. Еколошки и штедливи индустриски процеси кои користат биокатализатори долго време активно се воведени во хемиската, текстилната, фармацевтската, целулоза и хартијата, храната, енергијата и другите области на модерната индустрија.

Сепак, некои карактеристики на биокатализаторите ја прават нивната употреба неприфатлива во некои случаи. На пример, повеќето ензими се распаѓаат кога температурата се зголемува. Научниците се обидуваат да ги надминат таквите пречки и да ја зголемат стабилноста на ензимите во тешки услови на производство користејќи техники за инженерство на протеини.

Покрај индустриските апликации, инженерството на протеини најде достојно место во медицинскиот развој. Истражувачите синтетизираат протеини кои можат да се врзат и да ги неутрализираат вирусите и мутантните гени кои предизвикуваат тумори; создавање високо ефективни вакцини и проучување на рецепторните протеини на клеточната површина, кои често се цели на фармацевтските производи. Научниците за храна користат протеинско инженерство за да ги подобрат својствата на зачувување на протеините од растително потекло и средствата за гелирање или средствата за згуснување.

3.1 Библиотеки со пептиди и епитопи

Во жив организам, повеќето биолошки процеси се контролираат преку специфични интеракции протеин-протеин или протеин-нуклеинска киселина. Таквите процеси вклучуваат, на пример, регулирање на генската транскрипција под влијание на различни протеински фактори, интеракцијата на протеинските лиганди со рецепторите на површината на клетките, како и специфичното врзување на антигени со соодветните антитела. Разбирањето на молекуларните механизми на интеракција на протеинските лиганди со рецепторите е од големо фундаментално и применето значење. Особено, развојот на нови протеински лекови обично започнува со идентификација на почетната секвенца на аминокиселини која ја има потребната биолошка активност (т.н. „оловна“ секвенца). Сепак, пептидите со основна аминокиселинска секвенца може да имаат и непожелни биолошки својства: мала активност, токсичност, ниска стабилност во телото итн.

Пред појавата на пептидните библиотеки, подобрувањето на нивните биолошки својства беше спроведено со секвенцијална синтеза на голем број аналози и тестирање на нивната биолошка активност, за што беше потребно многу време и пари. Во последниве години, стана возможно да се создадат илјадници различни пептиди за кратко време со помош на автоматски синтисајзери. Развиените методи на насочена мутагенеза исто така овозможија драматично да се прошири бројот на протеини добиени истовремено и последователно тестирани за биолошка активност. Сепак, само неодамна развиените пристапи за создавање на пептидни библиотеки доведоа до производство на милиони секвенци на аминокиселини потребни за ефективен скрининг за да се идентификуваат меѓу нив пептидите кои најдобро ги исполнуваат критериумите. Ваквите библиотеки се користат за проучување на интеракцијата на антителата со антигени, добивање нови ензимски инхибитори и антимикробни агенси, дизајнирање на молекули со саканата биолошка активност или за давање нови својства на протеините, како што се антителата.

Врз основа на методите на подготовка, библиотеките на пептиди се поделени во три групи. Првата група вклучува библиотеки добиени со хемиска синтеза на пептиди, во кои поединечни пептиди се имобилизирани на микроносители. Со овој пристап, по додавањето на последователни амино киселини во поединечни реакциони смеси на пептиди имобилизирани на микроносители, содржината на сите реакциони мешавини се комбинира и се дели на нови делови, кои се користат во следната фаза на додавање на нови амино киселински остатоци. По низа такви чекори, се синтетизираат пептиди кои ги содржат секвенците на амино киселини кои се користат во синтезата во сите видови случајни комбинации.

Библиотеките на пептиди имобилизирани на микроносители имаат значителен недостаток: тие бараат употреба на прочистени рецептори во растворлива форма за време на скринингот. Во исто време, во повеќето случаи, рецепторите поврзани со мембраната најчесто се користат во биолошките тестови што се вршат за основни и фармаколошки истражувања. Според вториот метод, библиотеките на пептиди се добиваат со употреба на синтеза на пептиди во цврста фаза, во која во секоја фаза од хемиското додавање на следната аминокиселина во растечките пептидни синџири, се користат еквимоларни мешавини на сите или некои претходници на амино киселини. Во последната фаза на синтеза, пептидите се одвојуваат од носачот, т.е. претворајќи ги во растворлива форма. Третиот пристап за изградба на пептидни библиотеки, кој сега го опишуваме, стана остварлив токму благодарение на развојот на методите на генетско инженерство. Совршено ги илустрира можностите на таквите методи и несомнено е голем напредок во нивната примена. Во овој поглед, подетално ќе ги разгледаме резултатите од користењето на пептидните библиотеки во проучувањето на епитопите (антигенските детерминанти) на протеините.

Технологијата за генетско инженерство за производство на хибридни протеини овозможи да се развие ефикасен метод за производство на кратки пептиди за анализа на нивната биолошка активност. Како и во случајот со генските библиотеки, пептидните библиотеки добиени со методи на генетско инженерство претставуваат голем (често исцрпен) сет на кратки пептиди. Две неодамнешни набљудувања овозможуваат да се разгледа библиотека на пептиди истовремено и како библиотека на протеински епитопи. Прво, кратките пептиди можат да ги вклучат сите есенцијални амино киселински остатоци кои играат главна улога во интеракцијата на антителата и тие се способни да имитираат големи антигенски детерминанти на протеините. Второ, во повеќето случаи, нековалентните врски формирани помеѓу неколкуте најважни амино киселински остатоци од протеинските лиганди и нивните рецептори даваат голем придонес во вкупната енергија на интеракцијата лиганд-рецептор. Имајќи го ова на ум, секој пептид може да се смета за потенцијален лиганд, хаптен или дел од антигенската детерминанта на поголемите полипептиди, а секоја пептидна библиотека може да се смета за библиотека на протеински епитопи или потенцијални лиганди за соодветните протеински рецептори.

Пептидната библиотека добиена како резултат на имплементацијата на третиот пристап, во неговата модерна форма, е збир од десетици, па дури и стотици милиони кратки различни аминокиселински секвенци кои се изразени на површината на вирионите на бактериофагите како дел од нивните структурни протеини. Ова станува возможно благодарение на воведувањето на хибридни рекомбинантни гени кои ги кодираат изменетите структурни протеини на неговите вириони во геномот на бактериофагите користејќи методи на генетско инженерство. (Овој метод е познат како прикажување на фаг.) Како резултат на експресијата на таквите гени, се формираат хибридни протеини, на N- или C-крајот од кои се присутни дополнителни аминокиселински секвенци.

Библиотеките на пептиди и епитопи, исто така, ќе најдат нивна употреба во студиите за механизмите на хуморалниот имунолошки одговор, како и за болестите на имунолошкиот систем. Особено, повеќето автоимуни болести се придружени со формирање на автоантитела против антигените на сопствениот организам. Овие антитела во многу случаи служат како специфични маркери на одредена автоимуна болест. Користејќи библиотека на епитопи, во принцип, можно е да се добијат пептидни маркери, со помош на кои би можело да се следи специфичноста на автоантителата за време на развојот на патолошки процес и кај поединечен организам и кај група пациенти. и, дополнително, да се утврди специфичноста на автоантителата кај болести од непозната етиологија.

Библиотеките на пептиди и епитопи, исто така, може потенцијално да се користат за скрининг на имунолошките серуми за да се идентификуваат пептидите кои специфично комуницираат со заштитните антитела. Таквите пептиди ќе ги имитираат антигенските детерминанти на патогените организми и ќе служат како цели за заштитните антитела на телото. Ова ќе овозможи користење на такви пептиди за вакцинација на пациенти на кои им недостасуваат антитела против соодветните патогени. Студијата за епитопи кои користат пептидни библиотеки е посебен случај на една од многуте области на нивна употреба во применети и фундаментални студии за интеракцијата на лиганди и рецептори. Понатамошното подобрување на овој пристап треба да го олесни создавањето на нови лекови засновани на кратки пептиди и да биде корисно во фундаменталните студии за механизмите на интеракции помеѓу протеините и протеините.

3.2 Репортер протеини во фузија протеини

Во друг случај, фузионните протеини се користат за да се добијат високи нивоа на изразување на кратки пептиди во бактериските клетки поради стабилизирањето на овие пептиди во фузиските протеини. Хибридните протеини често се користат за да се идентификуваат и прочистат рекомбинантните протеини кои тешко се откриваат. На пример, со прикачување на галактозидаза на C-крајот на протеинот што се проучува како репортер протеин, можно е да се прочисти рекомбинантниот протеин врз основа на активноста на галактозидаза, одредувајќи ги неговите антигенски детерминанти со имунохемиски методи. Со комбинирање на фрагменти од ДНК кои содржат отворени рамки за читање (ORFs) со гените на протеините известувачи, можно е да се прочистат таквите хибридни протеини врз основа на активноста на протеинот известувач и да се користат за имунизација на лабораториски животни. Добиените антитела потоа се користат за прочистување на природниот протеин, кој го вклучува рекомбинантниот полипептид кодиран од ORF, и на тој начин да се идентификува клонираниот генски фрагмент.

Со помош на хибридни протеини се решава и обратниот проблем на клонирање на непознат ген, на протеинскиот производ од кој има антитела. Во овој случај, клонирана библиотека на нуклеотидни секвенци кои претставуваат ORF на непознати гени е конструирана во вектори кои овозможуваат ORF да се клонира за да се поврзе во истата рамка за читање со генот известувач. Хибридните протеини формирани како резултат на експресијата на овие рекомбинантни гени се идентификувани со користење на антитела со помош на методи на ензимска имуноанализа. Хибридните гени кои ги комбинираат секретираните протеини и репортерните протеини овозможуваат на нови начини да се проучат механизмите на секреција, како и локализацијата и движењето на секретираните протеини во ткивата.

3.3 Некои достигнувања на протеинско инженерство

1. Со замена на неколку амино киселински остатоци од лизозимот на бактериофагот Т4 со цистеин, се добил ензим со голем број дисулфидни врски, поради што овој ензим ја задржал својата активност на повисока температура.

2. Заменувањето на остаток од цистеин со остаток од серин во молекулата на човечки β-интерферон, синтетизиран од Escherichia coli, го спречи формирањето на интермолекуларни комплекси, кои ја намалија антивиралната активност на овој лек за приближно 10 пати.

3. Заменувањето на остатокот од треонин со остаток од пролин во молекулата на ензимот тирозил-тРНК синтетаза ја зголеми каталитичката активност на овој ензим десеткратно: тој почна брзо да го прикачува тирозинот за tRNA што ја пренесува оваа амино киселина во рибозомот за време на транслацијата.

4. Субтилизините се ензими богати со серин кои ги разградуваат протеините. Тие се излачуваат од многу бактерии и се широко користени од луѓето за биоразградување. Тие цврсто ги врзуваат атомите на калциум, зголемувајќи ја нивната стабилност. Меѓутоа, во индустриските процеси постојат хемиски соединенија кои го врзуваат калциумот, по што субтилизините ја губат својата активност. Со промена на генот, научниците ги отстранија амино киселините од ензимот кои се вклучени во врзувањето на калциумот и заменија една аминокиселина со друга со цел да ја зголемат стабилноста на субтилизинот. Изменетиот ензим се покажа дека е стабилен и функционално активен во услови блиски до индустриските.

5. Беше прикажана можноста за создавање ензим кој функционира како рестриктивен ензим кој ја расцепува ДНК на строго дефинирани места. Научниците создадоа хибриден протеин, чиј еден фрагмент препознава специфична низа на нуклеотидни остатоци во молекулата на ДНК, а другиот фрагментирана ДНК во овој регион.

6. Активатор на ткивен плазминоген е ензим кој клинички се користи за растворање на згрутчување на крвта. За жал, брзо се елиминира од циркулаторниот систем и мора да се администрира постојано или во големи дози, што доведува до несакани ефекти. Со воведување на три насочени мутации во генот на овој ензим, добивме долговечен ензим со зголемен афинитет за деградираниот фибрин и со иста фибринолитичка активност како и оригиналниот ензим.

7. Со замена на една аминокиселина во молекулата на инсулин, научниците обезбедија дека кога овој хормон се администрира субкутано кај пациенти со дијабетес, промената на концентрацијата на овој хормон во крвта е блиска до физиолошката што се јавува после јадење.

8. Постојат три класи на интерферони кои имаат антивирусно и антиканцерогено дејство, но покажуваат различни специфичности. Беше примамливо да се создаде хибриден интерферон кој ќе ги има својствата на трите типа интерферони. Беа создадени хибридни гени кои вклучуваат фрагменти од природни интерферонски гени од неколку типови. Некои од овие гени, интегрирани во бактериски клетки, обезбедија синтеза на хибридни интерферони со поголема антиканцерогена активност од матичните молекули.

9. Природниот човечки хормон за раст не се врзува само за рецепторот на овој хормон, туку и за рецепторот на друг хормон - пролактин. Со цел да се избегнат несаканите несакани ефекти за време на третманот, научниците одлучија да ја отстранат можноста хормонот за раст да се прикачи на рецепторот на пролактин. Тие го постигнаа ова со замена на некои амино киселини во примарната структура на хормонот за раст користејќи генетски инженеринг.

10. Додека развивале лекови против ХИВ инфекцијата, научниците добиле хибриден протеин, чиј еден фрагмент го обезбедувал специфичното врзување на овој протеин само за лимфоцитите погодени од вирусот, друг фрагмент извршил пенетрација на хибридниот протеин во засегнатата клетка и друг фрагмент ја нарушил синтезата на протеините во погодената клетка, што довело до нејзината смрт.

Протеините се главната цел на лековите. Во моментов се познати околу 500 цели за дејство на дрога. Во наредните години нивниот број ќе се зголеми на 10.000, што ќе овозможи создавање на нови, поефикасни и побезбедни лекови. Неодамна, беа развиени фундаментално нови пристапи за откривање лекови: не се единечни протеини, туку нивните комплекси, протеинско-протеинските интеракции и преклопувањето на протеините се сметаат за цели.

Заклучок

протеинска инженерска мутагенеза е изменета

Библиографија

1. Протеинско инженерство.

2. Протеинско инженерство. Мистерии на генетиката. /Вјачеслав Маркин // Тајни, гатанки, факти.

3. Протеинско инженерство. // Голема руска енциклопедија.

4. Протеинско инженерство. // Прирачник за хемичари 21.

5. Протеинско инженерство и ефикасност на лекови.

6. Протеинско инженерство. / А.И. Корнељук // Биополимери и ќелија.

7. Протеинското инженерство ќе ја подобри ефикасноста на лековите. // Популарна механика.

8. Протеинско инженерство. Примање на инсулин. // Биофил - научно и информативно списание.

9. Биотехнологија. Главни насоки и достигнувања. // Биологија за апликанти и наставници.

10. Богданов А.А., Медников Б.М. Моќ над генот / А. А. Богданов, Б. М. Медников - М.: Образование, 1989 - стр.208

11. Генетски инженеринг. // Здравје.

12. Гени и хемичари. // Генетика.

13. Глик Б., Пастернак Ј. Молекуларна биотехнологија. Принципи и примена / Б. Глик, Ј. Пастернак. - М.: Мир, 2002 година.

14. Други области на примена на генетскиот инженеринг. / Л.В. Тимошенко, М.В. Чубик // Медицина - вести и технологии.

15. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живукин Е.А. Основи на биотехнологијата. / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живукин - М., 2003 година.

16. Протеинско инженерство. // Хемија и биотехнологија.

17. Патрушев Л.И. Израз на гени / Л.И. Патрушев - М.: Наука, 2000. - 496 стр.

18. Патрушев Л.И. Вештачки генетски системи. Т. 1: Генетско и протеинско инженерство. /Л.И. Патрушев - М.: Наука, 2004. - 526 стр.

19. Рибчин В.Н. Основи на генетско инженерство: Учебник за универзитети/В.Н. Рибчин - Санкт Петербург: Издавачка куќа на Државниот технички универзитет во Санкт Петербург, 2002. - 522 стр.

20. Степанов В.М. Молекуларна биологија. Структури и функции на протеините. / В.М. Степанов - М.: Виша школа, 1996 година.

21. Биотехнолошки технологии: протеинско инженерство, нанобиотехнологија, биосензори и биочипови. / Евгенија Рјабцева // „Комерцијална биотехнологија“ - онлајн списание.

22. Чернавски Д.С., Чернавскаја Н.М. Протеинот е машина. Биолошки макромолекуларни структури. / Д.С. Чернавски, Н.М. Чернавскаја - М.: Издавачка куќа на Московскиот државен универзитет, 1999 година.

23. Шулц Г.Е., Ширмер Р.Х. Принципи на структурна организација на протеините. / Г.Е. Шулц, Р.Х. Ширмер - М.: Мир, 1982 година.

24. Браниган Ј.А., Вилкинсон А.Ј. Протеинско инженерство 20 години // Nature Reviews. Молекуларна клеточна биологија. 2002. Ред. 3. бр.12;

25. Протеинско инженерство. // Википедија, слободна енциклопедија.

Објавено на Allbest.ru

Слични документи

Суштината и задачите на генетскиот инженеринг, историјата на неговиот развој. Целите на создавање генетски модифицирани организми. Хемиско загадување како последица на ГМО. Добивањето хуман инсулин како најважно достигнување во областа на генетски модифицираните организми.

апстракт, додаден на 18.04.2013 година

Појавата на биотехнологијата. Главни насоки на биотехнологијата. Биоенергијата како гранка на биотехнологијата. Практични достигнувања на биотехнологијата. Историја на генетскиот инженеринг. Цели, методи и ензими на генетскиот инженеринг. Достигнувања на генетскиот инженеринг.

апстракт, додаден на 23.07.2008 година

Можности за растително генетско инженерство. Создавање на растенија отпорни на хербициди. Зголемување на ефикасноста на фотосинтезата и биолошката фиксација на азот. Подобрување на квалитетот на протеините за складирање. Еколошки, медицински и социо-економски ризици од генетскиот инженеринг.

тест, додаден на 15.12.2011 година

Суштината на генетскиот инженеринг, методи за идентификација на трансгенски организми; производство и технологија на ГМО, разлика од традиционалното одгледување, предности и недостатоци. Состојбата и изгледите за развој на пазарот на генетски модифицирани добра во светот.

работа на курсот, додадена на 20.11.2010 година

Генетскиот инженеринг е метод на биотехнологија кој се занимава со истражување на реструктуирање на генотиповите. Можности за генетски инженеринг. Изгледи за генетски инженеринг. Намалување на ризикот поврзан со генетските технологии.

апстракт, додаден на 04.09.2007 година

Генетски инженеринг: историја на потекло, општи карактеристики, предности и недостатоци. Запознавање со најновите методи на генетско инженерство и нивната употреба во медицината. Развој на генетски инженеринг во областа на сточарството и живинарството. Експерименти на стаорци.

се разбира работа, додаде 07/11/2012

Редоследот на техники на генетски инженеринг што се користат за создавање генетски модифицирани организми. Класификација на главните типови на рестриктивни ензими кои се користат за фрагментација на ДНК. Ензими кои синтетизираат ДНК на шаблон ДНК или РНК.

презентација, додадена на 27.04.2014 година

Суштината на генетскиот и клеточниот инженеринг. Главните задачи на генетска модификација на растенијата, анализа на штетноста на нивната потрошувачка како храна. Карактеристики на хибридизација на растителни и животински клетки. Механизмот на добивање лековити супстанции со користење на генетски инженеринг.

презентација, додадена на 26.01.2014 година

работа на курсот, додадена 05/10/2011

Основи и техники на клонирање на ДНК. Фази на генетски инженеринг на бактерии. Развој на генетски инженеринг на растенијата. Генетска трансформација и подобрување на растенијата користејќи агробактерии, извори на гени. Безбедност на генетски модифицирани растенија.

Хемиски, протеинот е единствен тип на молекула, кој е синџир на полиамино киселина или полимер. Составен е од секвенци на аминокиселини од 20 типа. Откако ја научија структурата на протеините, луѓето го поставија прашањето: дали е можно да се дизајнираат целосно нови секвенци на аминокиселини за да ги извршуваат функциите што им се потребни на луѓето многу подобро од обичните протеини? Најдоброто име за оваа смела идеја беше протеинско инженерство.

Роботот не можел точно да ги репродуцира секвенците на аминокиселините, односно направил грешки. Тој синтетизирал еден синџир со една низа, а друг со малку поинаков. Во една клетка, сите молекули на еден протеин се идеално слични едни на други, односно нивните секвенци се апсолутно идентични.

Ако изберете мутанти со потребните својства, да речеме, оние кои поефикасно обработуваат одредена супстрат, тогаш можете да изолирате од таков мутант изменет ензим, благодарение на што клетката стекнува нови својства. Но, овој процес трае многу долг временски период.

Така, можеме да заклучиме дека генетскиот инженеринг го отвори патот кон инженерството на протеини во неговата најрадикална форма. На пример, избравме протеин и сакавме да замениме еден остаток од аминокиселина во него со друг.

Пред да започнете со работа за замена, треба да подготвите ДНК вектор. Ова е вирусна или плазмидна ДНК со вграден ген за протеинот што не интересира. Исто така, треба да ја знаете нуклеотидната секвенца на генот и амино киселинската секвенца на кодираниот протеин. Последното се одредува од првото користејќи табела со генетски код.

Користејќи ја табелата, исто така е лесно да се одреди кои минимални промени треба да се направат во составот на генот, така што тој ќе почне да го кодира не оригиналот, туку протеин изменет на наше барање. Да речеме дека во средината на генот треба да го замените гванинот со тимин.

Поради толку мала работа, нема потреба од ресинтетизирање на целиот ген. Се синтетизира само мал фрагмент од нуклеотиди, комплементарни со регионот во чија средина се наоѓа нуклеотидот на гванин избран за замена.

Добиениот фрагмент се меша со ДНК вектор (кружна ДНК), кој го содржи генот што ни е потребен. ДНК прстенот и синтетизираниот фрагмент создаваат дел од двојната спирала Вотсон-Крик. Во него, централниот пар е „истуркан“ од двојната спирала, бидејќи е формиран од меѓусебно некомплементарни нуклеотиди.

Додадете четири dNTP и ДНК полимераза во растворот. Вториот, користејќи фрагмент заглавен на еден прстен, го комплетира до целосен прстен во целосна согласност со принципот на комплементарност.

Како резултат на тоа, добиваме речиси нормална векторска ДНК. Може да се внесе во квасец или бактериска клетка за репродукција. Единственото нешто е што оваа ДНК се разликува од оригиналниот вектор во некомплементарен пар. Со други зборови, векторската спирала на ДНК не е целосно совршена.

При првиот чин на удвојување на добиениот вектор заедно со бактериите што го носат, секоја од молекулите на ќерката на ДНК ќе стане совршена двојна спирала по целата должина. Меѓутоа, едната од молекулите ќерки го носи оригиналниот нуклеотиден пар, а другата има мутантен вектор на ова место, врз основа на кој се добива мутантниот протеин од интерес за нас.

Така, протеинскиот инженеринг создава мешавина од клетки. Некои од нив го носат оригиналниот вектор со немутантен ген, додека други клетки го носат мутантниот ген. Останува да се изберат од оваа мешавина токму оние клетки во кои се наоѓа мутантниот ген.

Методите на генетски инженеринг, особено клонирањето на поединечни гени или нивни делови, како и секвенционирањето на ДНК, овозможија значително да се подобри методологијата на мутагенезата, елиминирајќи ги главните недостатоци на класичните методи за индуцирање мутации во геномите. Класичната генетска анализа вклучува ефект на мутаген фактор in vivo врз целиот геном, како резултат на што во него се појавуваат случајни мутации, честопати повеќекратни, што во голема мера ја отежнува идентификацијата на мутанти. Мутантните поединци се идентификуваат со изменети фенотипски карактеристики, а природата на мутацијата може да се одреди по секвенционирањето на ДНК. Модерната локализирана мутагенеза, всушност, вклучува обратни дејства: прво, генот од интерес или неговиот сегмент се клонира, неговата структура се одредува за време на секвенционирањето, а потоа се прават потребните промени во неговиот состав ин витро. Последиците од индуцираната мутација се одредуваат по воведувањето на мутантниот ген во оригиналниот организам.

Наједноставната верзија на локализирана мутагенеза се состои од третирање на клониран фрагмент на ДНК со еден од мутагените фактори, но резултатот од таквата изложеност ќе бидат и случајни промени во структурата на фрагментот. Посигурни и почесто користени методи на локализирана мутагенеза се спроведуваат без употреба на мутагени фактори. Меѓу видовите мутации преовладуваат бришења, вметнувања и нуклеотидни замени.

Бришење.Овие типови на мутации во локализирана мутагенеза се добиваат со користење на ендонуклеази. Се користат и рестриктивни и неспецифични ендонуклеази. Наједноставниот случај на користење на рестриктивни ензими е да се расцепи геном со помош на рестриктивен ензим кој воведува неколку прекини за да се формираат лепливи краеви. Добиените фрагменти повторно се затвораат во прстен користејќи ДНК лигаза, што може да доведе до формирање на молекули кои не содржат еден од сегментите на ДНК. Овој пристап произведува обемни бришења и обично се користи во прелиминарни експерименти за да се одреди функцијата на релативно големи делови од клонирана ДНК.

Мали бришења се добиваат на следниов начин. Клонираниот фрагмент се расцепува во векторот на соодветното место со користење на рестриктивен ензим (сл. 21.1). Добиената линеарна молекула се третира со егзонуклеаза III, која хидролизира една нишка на ДНК,

почнувајќи од 3' крајот. Резултатот е збир на молекули со едноверижни опашки од 5' со различна должина. Овие опашки се хидролизираат со ssDNA-специфична S1 нуклеаза и се формираат бришења во ДНК. Можете исто така да користите егзонуклеаза Bal 31, која ја катализира деградацијата на двете нишки, почнувајќи од краевите на линеарните молекули на ДНК. Текот на нуклеотските реакции се регулира со менување на времето на инкубација, температурата и концентрацијата на ензимите, предизвикувајќи формирање на бришења со различни должини. Добиените варијанти на бришење на линеарната ДНК често се обезбедуваат со поврзувачи пред циклизацијата, така што местата за ограничување се присутни во регионот на бришењето. Постојат и други модификации на опишаните методи.

Вметнувања (внесувања).За да се добијат инсерции, клонираната ДНК се вари со рестриктивен ензим или неспецифична ендонуклеаза, а потоа добиените фрагменти се лигираат во присуство на сегментот што се сака да се вметне во ДНК. Најчесто како такви сегменти се користат хемиски синтетизирани полилинкери (Поглавје 20).

Вметнувањата, како и бришењата, може да го нарушат интегритетот на генот или структурата на неговите регулаторни региони, што резултира со синтеза на дефектен протеин (во случај на продолжени бришења или поместувања на рамката, обично неактивни) или промени во процесот на транскрипција на генот од интерес. На овој начин често се добиваат регулаторни мутанти и се конструираат експресивни вектори (Поглавје 20).

Точка мутации . Овие мутации се нуклеотидни замени. За нивно добивање, може да се користат неколку пристапи: цитозинска деаминација, инкорпорирање на нуклеотидни аналози, неправилно инкорпорирање на нуклеотиди при поправка на јазот итн.

Првиот метод се заснова на фактот дека остатоците од цитозин во едноверижна ДНК може да се деаминираат за да се формира урацил со третман со бисулфитни јони. Едноверижните региони во ДНК обично се добиваат во близина на рестриктивни места, на пример, со дејство на егзонуклеаза III. По обработката со бисулфит, едноверижните празнини се пополнуваат со помош на ДНК полимераза и краевите се врзуваат. Во местата каде што се формирал уридилат наместо цитидилат за време на деаминација, аденилат ќе ја заземе комплементарната позиција, а за време на репликацијата на таквата молекула парот GC ќе биде заменет со пар АТ.

Друг пристап за поттикнување супституции е третирање на клонирана ДНК со рестриктивен ензим во присуство на етидиум бромид, кој се вметнува помеѓу рамнините на базните парови и ја нарушува структурата на дуплексот. Како резултат на тоа, се формира само едножичен прекин на ДНК. Се создава мала празнина на местото на прекинот на една жичка, а потоа се поправа во присуство на ДНК полимераза, dATP, dGTP, dCTP и N-4-хидроксицитозин трифосфат наместо dTTP. Хидроксицитозин трифосфатот е вклучен во синџирот наместо тимидилат, но за време на репликацијата на ДНК тој подеднакво добро се спарува и со аденилат и со гванилат. Како резултат на вклучувањето на гванилат по дополнителен круг на репликација, замената AT→GC ќе се случи на ова место (сл. 21.2). Бидејќи во овој метод замената на нуклеотидите се врши внатрешно

место на ограничување, станува возможно лесно да се направи разлика помеѓу вектори со оригиналната низа и мутантните. За да го направите ова, доволно е да ги третирате со рестриктивниот ензим користен во експериментот: мутантните молекули нема да претрпат расцепување.

Сличен метод се заснова на користење само три од четирите можни нуклеотиди при пополнување на едноверижна празнина со ДНК полимераза. Во повеќето случаи, ензимот застанува во точката во молекулата каде што се јавува комплементарниот нуклеотид на исчезнатиот. Меѓутоа, повремено ДНК полимеразата прави грешка и вклучува еден од трите присутни нуклеотиди. Ова доведува до формирање на прстенести молекули, кои содржат неспарени некомплементарни азотни бази. Кога таквите вектори ќе се внесат во бактериските клетки, некои од молекулите ќе претрпат поправка на таквата штета. Како резултат на тоа, во половина од молекулите по репликацијата ќе се врати оригиналната низа, а во другата половина мутацијата ќе биде фиксирана. Мутантните молекули може да се разликуваат користејќи го методот опишан погоре.

Мутагенеза специфична на локацијата. Карактеризираните методи на локализирана мутагенеза се разликуваат по тоа што местата каде што се случуваат мутациите се избрани случајно. Во исто време, техниката на мутагенеза специфична локација овозможува да се воведат мутации во прецизно дефиниран регион на генот. Ова се прави со користење на синтетички (добиени со хемиска синтеза) олигонуклеотиди со дадена низа. Методот е погоден по тоа што не бара присуство на погодни места за ограничување. Методот се заснова на формирање на хетеродуплекси помеѓу синтетички олигонуклеотид кој содржи мутација и комплементарна едноверижна ДНК во векторот.

Постапете на следниов начин. Се синтетизира мал олигонуклеотид (8-20 мономери), комплементарен на делот од генот во кој сакаат да добијат мутација. Дозволени се една или повеќе нуклеотидни замени во централниот регион на олигонуклеотидот. Генот што се испитува или неговиот фрагмент се клонираат како дел од вектор базиран на фагот M13 за да се добие кружна едноверижна рекомбинантна ДНК. Рекомбинантните вектори се мешаат и се варат со олигонуклеотиди. Настанува хибридизација на олигонуклеотидот со комплементарниот регион, додека некомплементарните нуклеотиди остануваат неспарени. Олигонуклеотидот делува како прајмер во реакција на полимераза која вклучува ДНК полимераза ин витро. Прстенот е затворен со лигази. Резултирачката кружна молекула се внесува во клетките на E. coli, каде што се случува делумна поправка на местата за репликација на мутант. Фреквенцијата на мутации обично варира од 1 до 50%. Изборот на клетки кои содржат мутантни ДНК молекули може да се направи на неколку начини, меѓу кои предност е методот со користење на радиоактивно означен олигонуклеотид, кој се користи за мутагенеза. Во овој случај, овој нуклеотид служи како сонда. Принципот на користење на таква сонда се заснова на фактот дека таа е целосно комплементарна со мутантната ДНК и делумно комплементарна со ДНК од див тип. Можно е да се изберат такви услови за хибридизација (првенствено температура) што хибридизацијата на означената сонда ќе биде стабилна само со мутантната ДНК секвенца, која може да се открие со авторадиографија.

Методот на мутагенеза специфична локација е особено вреден бидејќи ви овозможува да ги изолирате мутациите без да ја контролирате нивната фенотипска манифестација. Овој метод отвора нови можности за проучување на функциите на регулаторните елементи на гените, ви овозможува да ја промените „јачината“ на промоторите, да ги оптимизирате местата за врзување на рибозомите итн. Една од главните примени на оваа методологија е протеинско инженерство.

Протеинско инженерство. Оваа фраза означува збир на методолошки техники кои овозможуваат реконструкција на протеинска молекула со насочено воведување на соодветни мутации во структурен ген (место специфична мутагенеза) и, следствено, саканите замени на аминокиселини во примарната структура на протеинот.

Илустративен пример за изградба на поактивни протеини се експериментите на Фершт и соработниците со ензимот тирозил-тРНК синтетаза од бактеријата Bacillus stearothermophilus. Анализата на последиците од замените на аминокиселините во активното место на овој ензим доведе до заклучок дека отстранувањето на групите кои формираат слаби водородни врски со подлогата може да го подобри неговиот афинитет кон супстратот. Откриено е дека треонин-51 (ја зазема позиција 51 во пептидот) формира долга и слаба водородна врска со кислородот од прстенот на рибозата кога го врзува тирозил аденилат. Во исто време, беше откриено дека пролинот ја зазема истата позиција кај бактериите E. coli. Место-специфична мутагенеза на генот што ја одредува структурата на B. stearothermophilus tyrosyl-tRNA синтетаза овозможи да се замени thr-51→pro -51во пептидот. Како резултат на тоа, врзувањето на АТП во активниот центар на ензимот нагло се подобри, а неговата каталитичка активност се зголеми за 25 пати.

Друг, не помалку значаен пример за реконструкција на протеини од практично значење е модификацијата на субтилизин од Bacillus amyloliquefaciens, спроведена од Естел и сор. Субтилизините се серински протеинази кои се излачуваат од бацилите во надворешната средина. Овие ензими се произведуваат во голем обем од биотехнолошката индустрија и широко се користат во детергентите. Недостаток на субтилизините е нагло намалување на протеолитичката активност под влијание на оксидирачки агенси, вклучително и оние содржани во прашокот за перење. Целта на реконструкцијата на молекулата на субтилизин BPN беше да се стабилизира против хемиска оксидација.

Во прелиминарните експерименти, беше откриено дека во присуство на водороден пероксид, субтилизинот брзо ја намалува активноста поради оксидацијата на остатокот од метионин-222, кој се претвора во соодветниот сулфоксид. Користејќи методи на мутагенеза специфични за локацијата, овој остаток на метионин беше заменет со сите други 19 протеински амино киселини. Плазмидите со мутантни гени беа внесени во соеви со бришења во соодветните гени и беа анализирани својствата на произведените субтилизини. Мутантите со серин и аланин222 се покажаа доста стабилни на дејството на пероксидот. Најактивен мутант беше оној што го содржи остатокот на цистеин-222; неговата специфична активност беше 38% повисока од онаа на сојот од див тип.

На сличен начин, беше можно да се зголеми активноста на б-интерферон. Други достигнувања на инженерството на протеини вклучуваат студии за разјаснување на трансформаторската активност на онкопротеините; промена на термостабилноста на ензимите, на пример, добивање на термолабилен ренин и термостабилна а-амилаза; зголемување на ефикасноста на врзувањето на инсулинот од соодветниот рецептор на плазма мембраната поради замена на хистидин со аспартат на позиција 10 од б-ланецот на хормонот, како и многу други примери. Голем број протеински инженерски производи веќе нашле практична примена во производствените процеси.

1.1 Концептот на протеинско инженерство. Историја на развој

Слика 1. Шема за тоа како функционира инженерството на протеини.

Протеинско инженерство

Видови и спецификација

Аристотел го користел терминот „вид“ за да опише слични животни. По појавата на делата на D. Ray (1686) и особено C. Linnaeus (1751-- 1762), концептот на видот цврсто се воспостави во биологијата како главна...

Повисока нервна активност во зрелоста

Функционирањето на мозокот остана нерешена мистерија за човештвото долги години. Не само свештенството, туку и научниците кои исповедале идеализам ги поврзувале сите ментални процеси во телото со мистериозна душа...

Генетските алгоритми во проблемот на оптимизација на реалните параметри

Она што се нарекува стандарден генетски алгоритам првпат беше опишано и детално истражено во делото на Де Јонг...

Генетскиот инженеринг

Генетскиот инженеринг се појави благодарение на работата на многу истражувачи во различни гранки на биохемијата и молекуларната генетика. За многу години, протеините се сметаа за главна класа на макромолекули. Имаше дури и претпоставка ...

Употреба на генетски инженеринг во лекување на болести и создавање лекови

Генетскиот инженеринг се појави благодарение на работата на многу истражувачи во различни гранки на биохемијата и молекуларната генетика...

Историја на генетиката

По широкото ширење на учењата на Чарлс Дарвин, еден од првите критичари што укажа на слаба точка во теоријата беше шкотскиот истражувач Ф. Џенкинс. Во 1867 година, тој забележа дека во Дарвиновата теорија нема јасност за прашањето за ...

Концепти за развој на современи технологии и енергија

За да се олесни физичкиот труд, уште од античко време, измислени се различни уреди, механизми и машини кои ги подобруваат човечките механички способности. Но, само неколку механизми му помогнаа на човекот да работи ...

Карактеристики на клонирање

Раси на кокошки и нивната модерна дистрибуција

Живинарството во повеќето земји во светот зазема водечка позиција меѓу другите гранки на земјоделското производство, обезбедувајќи му на населението високо вредни диететски прехранбени производи (јајца, месо, вкусен масен црн дроб)...

Проблемот на постоењето на човештвото во светлината на теоријата за ноосферата на Вернадски

Врз основа на набљудувањата на природните појави, идејата дека живите суштества имаат интеракција со надворешната средина и влијаат на нејзините промени се појави многу одамна...

Цитогенетиката како наука

Цитогенетиката е наука за материјалната основа на наследноста. Таа ги проучува карактеристиките на структурата, репродукцијата, рекомбинацијата, промените и функционирањето на генетските структури на клетката, нивната дистрибуција во митозата...

Еволуција на групи на организми

Теоријата на еволуцијата е доктрина за општите обрасци и движечки сили на историскиот развој на живата природа. Целта на оваа настава: да се идентификуваат моделите на развој на органскиот свет за последователно управување со овој процес...

Протеинско инженерство 6 Збир на методи и пристапи за проучување на протеини и добивање протеини со нови својства ГЛАВНИ ЗАДАЧИ Креирај клонска библиотека со секвенци на нуклеотиди и аминокиселини Истражување на ефектите од поединечни замени на остатоци од аминокиселини врз преклопувањето на протеините и функциите Развивање методи за ефикасно менување протеини за да им ги даде потребните својства Развивање методи и пристапи за скрининг и избор на протеини со потребните својства

Рационален дизајн Рационален дизајн Потребата од знаење за просторната организација на протеинот Потребата од знаење за интра- и интермолекуларните интеракции Несовршеност на методите и опремата насока насочена кон создавање нови протеини de novo со нивниот просторен дизајн

Насочената еволуција на протеинските молекули е насока насочена кон создавање нови протеини преку селекција 1, добивајќи библиотека од случајни аминокиселински секвенци 2 избирајќи полипептидни синџири кои имаат барем мал степен на потребните својства 3 користејќи случајна мутагенеза, добивајќи нова библиотека на протеини кои се се користи во следниот круг на селекција или со користење на генетски инженерски конструкции кои изразуваат нови протеини

Насочена еволуција на протеинските молекули (опции) рационален редизајн со помош на насочена мутагенеза замени специфични амино киселински остатоци во активниот центар на ензимското инженерство на протеинските површини со помош на мутации кои ги менуваат деловите на полипептидниот синџир во близина на остатоците од аминокиселини кои се блиску еден до друг на површината на протеинската топка, но лоцирана на значително растојание во полипептидниот синџир одвоени едни од други

Скрининг и избор на протеини со специфицирани својства случаен скрининг подобрена скрининг селекција секој протеин се испитува за присуство на потребните својства; изборот на протеини од библиотеката се случува по случаен избор, секој протеин се испитува за присуство на потребните својства; изборот на протеини од библиотеката се случува случајно; можно е ако предметите што ја сочинуваат библиотеката фенотипски се разликуваат (на пример, во присуство на ензимска активност); се создаваат услови за селективно зачувување на компонентите на библиотеката што имаат одредени својства (фаг, клеточен приказ); се создаваат услови за селективно зачувување на компонентите на библиотеката; кои имаат одредени својства (фаг, клеточен приказ) откривање на протеин со потребните својства меѓу голем број макромолекули што го сочинуваат добиената клонирана библиотека

Приказ на фаг Целта е да се прикажат туѓи протеини на површината на фагот Методот е развиен во 1985 година за филаментозен бактериофаг М13. (гените pIII и pVIII се погодни целни места за вметнување на туѓ cDNA фрагмент) Целта е да се изложат туѓи протеини на површината на фагот Методот е развиен во 1985 година за филаментозен бактериофаг М13. (гените pIII и pVIII се погодни целни места за вметнување на туѓ фрагмент од cDNA) се конструира хибриден ген кој се состои од кодирани секвенци на целниот протеин и еден од протеините на обвивката на фагот од страна на бактериофагот; E. coli е инфициран за време на фагот склопување; хибридните протеини се вклучени во честичката на фагот

Фаг-помошник на фаг Геном на фаг Инфекција на E.coli со помошен фаг Клетките на E.coli трансформирани со плазмидна библиотека/фагемид се инфицирани со помошен фаг за да се добијат честички на фагот на чија површина се изложени различни варијанти на целниот протеин E. coli клетките трансформирани со плазмидна библиотека/фагемид, се инфицирани со помошен фаг за да се добијат честички на фагот на чија површина се изложени различни варијанти на целниот протеин.

Изгледи за практична употреба на протеинско инженерство Медицина: *за производство на нови лекови; за создавање на дијагностички алатки и производство на вакцини; *за изучување на механизмите на имунолошкиот одговор, како и болестите на имунолошкиот систем Екологија: *за добивање биокатализатори во форма на цели клетки со ензими имобилизирани на нивната површина; *за добивање биосензори за дијагностика и мониторинг на животната средина; *за создавање на био адсорбенти за отстранување на токсичните материи и јоните на тешките метали од околината

Мерење на гликоза со помош на ензимска електрода (шематски приказ на експериментот на Л. Кларк). Оксидација на гликоза со ензимот глукоза оксидаза во присуство на кислород: гликоза + O 2 H 2 O 2 + глуконо-1,5-лактон. H 2 O 2 се намалува на платинската електрода со потенцијал од +700 mV; струјата што тече во колото е пропорционална со концентрацијата на водород пероксид (т.е. индиректно, гликоза).